宋 媛 周池虹伶 歐仕益

（1．暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院校門診部，廣東 廣州 510632；2．暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）已逐漸成為繼心血管病、腫瘤之后嚴(yán)重威脅人類健康的第三大疾病［1］。在糖尿病人中，超過90%的病人屬于Ⅱ型糖尿?。ǚ且葝u素依賴型糖尿病），這類病人不需要胰島素的治療，僅用飲食調(diào)節(jié)即可有效控制血糖［2］。在飲食調(diào)節(jié)無效的情況下就需增加藥物治療，其中α－葡萄糖苷酶抑制劑具有較好的療效，被認(rèn)為是Ⅱ型糖尿病的首選藥和Ⅰ型糖尿病的胰島素治療的輔助藥物［3］。其作用機(jī)制：可競爭性地抑制寡糖的分解，延緩了雙糖、低聚糖及多糖分解為葡萄糖，從而降低餐后血糖［4］。

目前，醫(yī)學(xué)界公認(rèn)療效較好的α－葡萄糖苷酶抑制劑就是通過抑制α－淀粉酶的活性來達(dá)到治療目的，α－淀粉酶抑制劑是屬于糖苷水解酶抑制劑中的一種，它因能阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，降低血糖和血脂含量水平值而被廣泛研究［5］。α－淀粉酶和α－葡萄糖苷酶抑制劑的制備大多采用微生物發(fā)酵法，原料來源少，生產(chǎn)成本高，因此，有必要從天然藥物原料中尋找安全高效的α－淀粉酶抑制劑來防治糖尿病。

酚酸類化合物是一類含有酚羥基和羧基的一類物質(zhì)，研究［6－8］表明，酚類物質(zhì)能與蛋白相互作用從而影響酶的活性。綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸組成的一類縮合酚酸，是金銀花、杜仲等中藥材的活性成分，具有抗氧化、保護(hù)心血管、抗誘變、抗癌、抗菌、抗病毒、降脂降糖和免疫調(diào)節(jié)等作用［9］。阿魏酸的化學(xué)名稱為4－羥基－3－甲氧基肉桂酸，是當(dāng)歸、川芎等中藥材的活性成分，具有抗氧化、抗血栓、降脂、抗菌消炎、抗突變和預(yù)防癌腫等作用［10］。對－香豆酸的化學(xué)名稱為4－羥基肉桂酸，是杜仲葉的有效成分之一，具有抗氧化、抗菌和抗突變、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、利膽、調(diào)節(jié)免疫、提高精子活力、抑制黑色素形成、預(yù)防由亞硝酸鹽引起的結(jié)腸炎等作用，能有效降低心血管疾病的發(fā)病率［11，12］。阿魏酸和綠原酸已被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為保健食品原料［13］，是一類安全、無害的物質(zhì)。關(guān)于3種酚酸協(xié)同對α－淀粉酶活性的影響目前未見報(bào)道。因此本研究擬選用阿魏酸、綠原酸、對－香豆酸3種酚酸協(xié)同研究其對α－淀粉酶的抑制作用，以期開發(fā)一類新型α－淀粉酶抑制劑用作糖尿病人的功能性食品。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

可溶性淀粉、苯酚、葡萄糖：AR 級，天津市大茂化學(xué)試劑廠；

α－淀粉酶：2 000U／g，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

阿魏酸、對－香豆酸：98%，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；

綠原酸：97%，遠(yuǎn)航生物技術(shù)有限公司；

磷酸氫二鈉：AR 級，天津市化學(xué)試劑廠；

吐溫20：CP級，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉：AR級，天津市福晨化學(xué)試劑廠；

3，5－二硝基水楊酸（DNS）：AR 級，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1．2 儀器與設(shè)備

水浴恒溫振蕩器：SHA－B型，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；

低速離心機(jī)：KDC－1044型，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV－9600型，北京瑞利分析儀器公司；

精密電子天平：HR－200型，廣州市艾安德儀器有限公司；

電子天平：MP5002B型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

電磁爐：KY－PC113A－L型，松下電器（中國）有限公司。

1．3 方法

1．3．1 酚酸對α－淀粉酶活力的影響 用0．05 mol／L 磷酸鹽緩沖液（pH＝6．5）分別配制質(zhì)量濃度為2 U／mL 的α－淀粉酶液和40 mg／mL 的可溶性淀粉溶液，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0．1%，0．2%，0．4%的阿魏酸、綠原酸、對－香豆酸溶液（配制時(shí)，加入體積分?jǐn)?shù)2%的吐溫20使酚酸完全溶解）。

取100mL三角瓶，各加入10mL酶液和25mL酚酸溶液，在37 ℃的恒溫振蕩器振蕩（100r／min）保溫5min后，加入25mL的可溶性淀粉溶液，再將其在37 ℃的恒溫振蕩器振蕩（100r／min）反應(yīng)30 min，取1 mL 樣液于離心管中，加入1mol／L 的氫氧化鈉1 mL 終止酶促反應(yīng)，稀釋5 倍，離心，取1mL上清液，用3，5－二硝基水楊酸法（DNS法）測定還原糖，各處理重復(fù)3次。

1．3．2 酚酸混合物對α－淀粉酶活力的影響 在1．3．1研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇不同濃度的3 種酚酸復(fù)配，觀察其對α－淀粉酶的抑制作用。

1．3．3 淀粉酶抑制率的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2．1 3種酚酸單獨(dú)存在時(shí)對α－淀粉酶活力的影響

不同濃度的3種酚酸對α－淀粉酶活力的影響見表1。由表1可知，酚酸種類和濃度對α－淀粉酶活力的影響很大。阿魏酸添加量為0．02%時(shí)對α－淀粉酶有微弱的促進(jìn)作用，隨著添加濃度的增加，抑制作用增加；濃度再進(jìn)一步增加時(shí)抑制效果反而下降。綠原酸在添加量為0．05%時(shí)抑制作用達(dá)到最高，而后隨著添加量的增加抑制效果下降；香豆酸的影響趨勢與綠原酸近似，但添加量大于0．2%時(shí)反而提高α－淀粉酶活力。

表1 不同質(zhì)量濃度的酚酸對α－淀粉酶的抑制百分率Table1 Effect of different concentrations of phenolic acids on the inhibition ofα－amylase（n ＝3） ／%

阿魏酸和香豆酸是纖維質(zhì)中含有的酚酸，研究阿魏酸和香豆酸對纖維素酶和木聚糖酶的影響有些報(bào)道。研究［14，15］發(fā)現(xiàn)，高濃度的酚酸（10～50mM）會抑制纖維素酶和木聚糖酶活性，而低濃度的酚酸則提高這兩種酶的活性［16］。本課題組［17］曾采用紫外、熒光和圓二色譜研究發(fā)現(xiàn)，酚酸的加入會影響纖維素酶的空間結(jié)構(gòu)，降低α螺旋含量，增加β折疊和無規(guī)線團(tuán)含量。因此，適當(dāng)濃度的酚酸可增加纖維素酶的柔性，提高酶的活力。同時(shí)，酚酸可和酶活性中心所含芳香族氨基酸反應(yīng)，從而降低酶的活性，因此酚酸究竟是促進(jìn)還是抑制纖維素酶活性，關(guān)鍵取決于其添加濃度。

由于α－淀粉酶能催化淀粉α－1，4糖苷鍵水解，而酚酸對α－淀粉酶的作用機(jī)制可能與其對纖維素酶和木聚糖酶的作用機(jī)制類似。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為0．05%的阿魏酸、綠原酸以及對－香豆酸對α－淀粉酶的抑制百分率較高。這也提示在此濃度下這3 種酚酸對α－淀粉酶抑制作用較大，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究3 種酚酸同時(shí)添加時(shí)對α－淀粉酶的抑制作用。

2．2 3種酚酸復(fù)配對α－淀粉酶活力的影響

由表1結(jié)果可知，酚酸濃度對α－淀粉酶活力影響很大。故將酚酸總濃度控制在0．2%以下進(jìn)行復(fù)配添加，研究了其對α－淀粉酶活力的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度酚酸復(fù)配后對α－淀粉酶的抑制作用Table2 Effect of mixture of phenolic acids on the inhibition ofα－amylase（n ＝3） ／%

由表2可知，在合適的濃度下，3種酚酸對α－淀粉酶的抑制表現(xiàn)出協(xié)同作用，抑制率為12．62%～98．77%；當(dāng)阿魏酸、綠原酸和對－香豆酸的質(zhì)量濃度分別為0．07%，0．05%和0．04%時(shí)，α－淀粉酶活力幾乎完全被抑制，抑制率達(dá)到98．77%。

3 結(jié)論

酚酸混合液具有較好的協(xié)同抑制作用。與纖維素酶和木聚糖酶的活性中心氨基酸組成不同，淀粉酶活性中心沒有芳香族氨基酸，因此酚酸對α－淀粉酶的的協(xié)同作用機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。

酚酸類化合物是一類含有酚羥基和羧基的一類物質(zhì)，酚類物質(zhì)能與蛋白相互作用從而影響酶的活性。通過體外試驗(yàn)研究，表明阿魏酸、綠原酸、對－香豆酸這3 種酚酸的混合液在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制α－淀粉酶的活力。3 種酚酸在質(zhì)量濃度為0．05%時(shí)，具有較好的抑制效果；當(dāng)阿魏酸、綠原酸和對－香豆酸分別按0．07%，0．05%和0．04%的質(zhì)量濃度混合添加時(shí)，對α－淀粉酶抑制率達(dá)到98．77%，表明這3種

1 周琦，劉一輝．糖尿病研究及其防治［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（4）：560～562．

2 雷瑞莉．2型糖尿病患者的飲食指導(dǎo)［J］．基層醫(yī)學(xué)論壇，2013，17（7）：297～298．

3 樊竹青．α－葡萄糖苷酶抑制劑治療糖尿病的研究進(jìn)展綜述［J］．思茅師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2005，21（3）：3～5．

4 尚健，郭啟煜．α－糖苷酶抑制藥治療糖尿病的研究［J］．臨床藥物治療雜志，2010，8（4）：39～43．

5 黃紹華，胡曉波，王震宙．山藥多糖對α－淀粉酶活力的抑制作用［J］．食品工業(yè)科技，2006，27（9）：94～95．

6 杜淑霞，歐仕益，貝惠玲，等．茶多酚與牛乳蛋白互作對蛋白質(zhì)離體消化率的影響［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（2）：76～79．

7 歐仕益．大豆非蛋白成分與蛋白質(zhì)的互作［J］．中國乳品工業(yè)，2010，38（1）48～50．

8 Kroll J，Rawel H M，Rohn S．Reactions of plant phenolics with food proteins and enzymes under special consideration of covalent bonds［J］．Food Science and Technology Research，2003，9（1）：205～218．

9 劉穎，郭明曄，白根本．綠原酸的研究進(jìn)展［J］．中藥材，2012，35（7）：1 180～1 185．

10 Ou S Y，Kwok K C．Review ferulic acid：pharmaceutical functions，preparation and applications in foods［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2004，84（11）：1 261～1 269．

11 陳惠芳．植物活性成分辭典：第二冊［M］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2001：386～388．

12 Ou S Y，Luo Y L，Huang C H，et al．Production of coumaric acid from sugarcane bagasse［J］．Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（2）：253～259．

13 凌關(guān)庭．保健食品原料手冊［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006．

14 Boukari I，O’Donohuec M，Rémond C，et al．Probing a family GH11endo－1，4－xylanase inhibition mechanism by phenolic compounds：Role of functional phenolic groups［J］．Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2011，72（1）：130～138．

15 Ximenes E，Kim Y，Mosier N，et al．Deactivation of cellulases by phenols［J］．Enzyme and Microbial Technology，2011，48（1）：54～60．

16 Kay F，Heitmann J A，Joyce T W．Influence of lignin and its degradation products on enzymatic hydrolysis of xylan［J］．Journal of Biotechnology，2000，80（2）：241～247．

17 Tian Y，Jiang Y，Ou S Y．Interaction of cellulase with three phenolic acids［J］．Food Chemistry，2013，138（2～3）：1 022～1 027．