黃玉軍 梁文星 劉 冬 陳大衛(wèi) 顧瑞霞

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009）

流行病學(xué)和臨床研究的結(jié)果［1］表明：人體膽固醇含量與心血管疾病之間存在著顯著的正相關(guān)。世界衛(wèi)生組織（WHO）預(yù)測(cè)［2］，至2030年，將有近2 360萬(wàn)人將死于心血管疾病。雖然藥物治療有一定的療效，但也有一些副作用。因此，人們?cè)噲D尋找更多的安全途徑來(lái)治療高膽固醇血癥。

益生菌是一類能夠?qū)θ梭w健康起到促進(jìn)作用的活體微生物。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)其具有多種生物活性［3，4］，其中降低血清膽固醇水平是其重要的生理活性之一。自從1963年Shaper［5］和Mann等［6］發(fā)現(xiàn)L．a(chǎn)cidophilus 發(fā) 酵 酸 奶 對(duì) 非 洲部落成年男性血清膽固醇水平具有潛在的調(diào)節(jié)功能后，對(duì)具有降解膽固醇益生菌的篩選及作用機(jī)理的研究變得越來(lái)越廣泛。近年來(lái)，研究者已從動(dòng)物腸道及傳統(tǒng)發(fā)酵制品中篩選出了許多具有降膽固醇功能的菌株，主要包括嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、瑞士乳桿菌、加氏乳桿菌、屎腸球菌、長(zhǎng)雙歧桿菌和乳雙歧桿菌等［7－9］。2000年5個(gè)國(guó)際研究機(jī)構(gòu)對(duì)丹麥 MD 食品公司生產(chǎn)的Gaio 酸奶（由E．faecium 和St．thermophilus 混合發(fā)酵）進(jìn)行了降膽固醇性能研究［10］，結(jié)果顯示Gaio酸奶對(duì)人體血清TC 和LDL－C水平的降低幅度分別達(dá)4%和5%，這些研究結(jié)果為預(yù)防和治療高血脂癥等疾病提出了新的理念和可能途徑。

本課題組前期已通過人工模擬胃、腸道環(huán)境，從江蘇如皋長(zhǎng)壽人群腸道中篩選出一株耐酸、耐膽鹽及體外降膽固醇能力較好的乳酸菌。本試驗(yàn)主要研究該菌在大鼠體內(nèi)的降膽固醇特性，為乳酸菌的人體臨床試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

1．1．1 菌株

試驗(yàn)菌株：分離自江蘇如皋長(zhǎng)壽人群腸道的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum ）。

1．1．2 主要試劑

脫脂乳粉、濃磷酸、濃硫酸、無(wú)水乙醇、氯化鈣、三氯化鐵、甲醇、氯仿、膽固醇、Trition－100、石油醚等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

總膽汁酸試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1．2 主要試驗(yàn)儀器

可見光分光光度計(jì)：722 型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：SCIENZ－ⅡD 型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－6型，國(guó)華電器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：WS2－134－75型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：5804R 型，德國(guó)Eppendorf公司；

生化培養(yǎng)箱：WS2－134－75型，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；

全自動(dòng)滅菌鍋：JF－SX－500型，日本Tomy公司；

酶標(biāo)儀：Bio－Tek ELX800型，美國(guó)寶特公司；

透射電子顯微鏡：Tecnai 12型，荷蘭Philips公司。

1．3 灌胃菌液的制備

（1）菌懸液組：將活化三代的菌株以5%接種量接種于2L MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h；將培養(yǎng)液4 000r／min離心5min，收集菌體于10%脫脂乳中，用生理鹽水稀釋至108，107，106CFU／mL 作 為 高、中、低 濃 度 的 菌 液 進(jìn) 行 灌胃［11］，根據(jù)大鼠體重進(jìn)行灌胃，灌胃量為2．0mL／100g。

（2）發(fā) 酵 乳 組：按4% （V／V）的 量 接 種 到 脫 脂 乳 中37 ℃發(fā)酵6h 后灌胃，根據(jù)大鼠體重進(jìn)行灌胃，灌胃量為2．0mL／100g。

1．4 試驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)

初斷乳雄性3周齡SPF 級(jí)Wistar大鼠，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，合格證：SCXK（蘇）2007－0001；基礎(chǔ)飼料、高脂飼料均由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供；大鼠飼養(yǎng)及試驗(yàn)均在本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行，動(dòng)物房保持通風(fēng)、透光和清潔衛(wèi)生，大鼠每天自由進(jìn)食、進(jìn)水。

Wistar大鼠雌雄各30只，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)4d后，隨機(jī)分為8組，每組10只。按照表1的方案，連續(xù)28d在上午對(duì)大鼠灌胃，參考《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003年版）》建立高脂血癥大鼠模型。

1．5 樣本處理

1．5．1 血清處理 大鼠最后一次灌胃后禁食12h，摘眼球取血，血液室溫放置60min，3 000r／min 離心10～15 min，取上清液分裝于塑料試管中，置－20 ℃冰箱，備用。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方式Table1 Animal grouping and feeding styles

1．5．2 肝勻漿制備 大鼠頸椎脫臼處死，迅速摘取肝臟左葉在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗數(shù)次，濾紙吸干，稱取0．8g左右的組織塊，加入約為組織塊重量9倍的預(yù)冷生理鹽水充分研碎，制成10%肝組織勻漿。

1．5．3 糞便中膽汁酸的提取 在試驗(yàn)的最后3d，每天隨機(jī)收集各試驗(yàn)組的糞便，烘干至恒重；取2g干糞用無(wú)水乙醇80 ℃提取3次，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40～50 ℃蒸干，加入石油醚，充分混勻，留沉淀；用含2% Trition－100的乙醇溶解沉淀，取上層液，再在水浴鍋中80 ℃蒸干得沉淀，最后用蒸餾水溶解，即為提取的糞膽汁酸溶液。

1．6 測(cè)定指標(biāo)和方法

1．6．1 血清TC、TG、HDL－C 和LDL－C 的測(cè)定 將冷藏血清送揚(yáng)州中醫(yī)院血液檢驗(yàn)科檢驗(yàn)，并按式（1）、（2）計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)及抗動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)。

式中：

AI—— 動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)；

AAI—— 抗動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)；

TC—— 血清總膽固醇，mmol／L；

HDL－C—— 高密度脂蛋白，mmol／L。

1．6．2 糞便中膽汁酸的測(cè)定 用總膽汁酸試劑盒測(cè)定總膽汁酸含量［12］。

1．6．3 肝臟和糞便中膽固醇含量的測(cè)定 取0．1mL 肝勻漿 加 入4．9mL 無(wú) 水 乙 醇 混 勻，室 溫 放 置10 min，4 000r／min離心10min，取上清2mL加入磷硫鐵2mL 顯色，560nm 波長(zhǎng)下測(cè)各樣本吸收值。

取0．3g 粉末狀的干燥糞便，用甲醇與氯仿（2∶1）的混合物定 容 至3 mL，45 ℃水 浴1h 后，8 000r／min 離 心10min，取上清0．2mL加入3．8mL無(wú)水乙醇混勻，取2mL溶液加入2 mL 磷硫鐵顯色，560nm 波長(zhǎng)下測(cè)各樣本吸收值。

1．6．4 透射電鏡標(biāo)本制備 取大鼠肝左葉和心臟相同部位，戊二醛固定，Epon 812、環(huán)氧樹脂包埋，切成5μm 薄片，醋酸鈾、硝酸鉛雙層染色后電鏡透射觀察肝臟、心臟切片［13，14］。

1．6．5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用SPSS 19．0 系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，在P＜0．05 的水平下，進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2．1 f5菌株對(duì)各組大鼠臟器系數(shù)的影響

試驗(yàn)期間，各組小鼠毛色光潔、食欲正常、精神活躍，未出現(xiàn)異常體征，未發(fā)生自然死亡。小鼠體質(zhì)量及肝、腎、心、脾與體質(zhì)量的百分比見表2。

表2 f5菌株對(duì)大鼠體質(zhì)量及臟器質(zhì)量與體質(zhì)量比的影響Table2 Effect of strain f5on body weight and viscera weight of rats with hyperlipemia（x±sd，n ＝10） ／（10－2 g·g－1 ）

正常試驗(yàn)動(dòng)物各臟器與體重的比值較為恒定，而當(dāng)動(dòng)物臟器病變后，受損臟器重量可能發(fā)生改變，故臟體比也隨之發(fā)生改變。臟體比增大，表示臟器可能已經(jīng)充血、水腫或增生等；臟體比減小，表示臟器已經(jīng)萎縮或發(fā)生其它改變。

由表2可知，與對(duì)照組相比，模型組的臟器與體重的比值顯著增高（P＜0．05），這說明了高膽固醇飼料的喂養(yǎng)使脂肪在大鼠肝臟上堆積，造成了肝臟重量增加。不同劑量的菌懸液組和發(fā)酵乳組與模型組相比，具有顯著性差異（P＜0．05），而與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0．05），表明菌株能夠有效地降低肝臟脂肪的堆積。各組間的腎臟、心臟、脾臟的臟器系數(shù)數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0．05），說明菌株未使試驗(yàn)動(dòng)物臟器產(chǎn)生病變。

2．2 f5菌株對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響

由表3可知，與模型組相比，高、中、低濃度組和發(fā)酵乳組的TC 和TG 的濃度都有所下降；其中高濃度組和發(fā)酵乳組與模型組相比，有顯著性差異（P＜0．05），中、低劑量組的TC和TG 水平也有所降低，但與模型組相比，無(wú)顯著性差異（P＞0．05）。

與模型組相比，灌胃組的LDL－C 都顯著下降（P＜0．05），劑量越高，效果越顯著；在整個(gè)試驗(yàn)中，HDL－C 都保持著相對(duì)比較穩(wěn)定，沒有顯著性升高和降低，這與謝寧的乳酸桿菌對(duì)高脂飲食大鼠膽固醇影響的研究結(jié)果［15］一致，飼喂高脂飼料大鼠的HDL－C 比飼喂普通飼料的HDL－C 濃度高，這可能是由大鼠體內(nèi)血清總膽固醇升高引起的，因?yàn)镠DL－C在生理上起著將肝外組織的膽固醇運(yùn)送到肝臟內(nèi)部的作用，因此，當(dāng)游離膽固醇在肝外組織細(xì)胞上沉積時(shí)，HDL－C就會(huì)增多，以防止其沉積。

與模型組相比，灌胃組的AI、AAI指數(shù)都有所下降，其中高、中濃度組和發(fā)酵乳組有顯著性差異（P＜0．05），但是低濃度組差異性不顯著（P＞0．05），表明f5菌株的高、中濃度菌懸液組和其發(fā)酵乳皆具有一定的調(diào)節(jié)血脂的功效，對(duì)于預(yù)防心血管疾病具有顯著效果。

2．3 f5菌株對(duì)大鼠肝臟中膽固醇含量的影響

肝臟可以將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，經(jīng)腸道排出體外。由表4可知，模型組肝臟中的膽固醇含量顯著高于對(duì)照組（P＜0．05），說明喂養(yǎng)高脂飼料使肝臟中膽固醇含量增高；高、中濃度組和發(fā)酵乳組的肝臟膽固醇含量顯著低于模型組（P＜0．05），說明菌株f5 對(duì)大鼠的肝臟分解膽固醇具有促進(jìn)作用，能夠通過肝臟將膽固醇轉(zhuǎn)化和分解。

表3 f5菌株對(duì)大鼠血脂的影響Table3 Effect of strain f5on blood lipids in rats（x±sd，n ＝10）

表4 肝臟中膽固醇的含量Table4 The content of liver cholesterol（x±sd，n ＝10）

2．4 f5菌株對(duì)大鼠糞便中膽固醇和膽汁酸含量的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，模型組的糞便膽固醇和膽汁酸含量均有顯著性差異（P＜0．05），灌胃后，高、中濃度組和發(fā)酵乳組的糞便膽固醇和膽汁酸的含量都有明顯升高（P＜0．05），說明體內(nèi)膽固醇的降解可以通過形成糞便排泄出體外，也可以形成膽汁酸排出體外。

表5 糞便中膽固醇和膽汁酸的含量Table5 The contents of cholesterol and bile acid in feces（x±sd，n ＝10） ／（mg·g－1 ）

2．5 對(duì)不同組別大鼠肝臟、心臟切片的觀察

不同組別肝臟組織切片如圖1所示，對(duì)照組中肝臟組織中無(wú)脂肪變性，肝臟的整體結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈索狀排列，在中央靜脈周圍呈放射狀分布；模型組中的脂肪泡明顯比正常組多，密度顆粒都比較大。在相同的放大倍數(shù)下，可發(fā)現(xiàn)高濃度組脂肪顆粒明顯下降，幾乎接近對(duì)照組；而低濃度組中肝臟細(xì)胞中的脂肪空泡仍然較多。

不同組別心臟組織切片如圖2所示，對(duì)照組中心肌纖維組織排列整齊，且線粒體均勻分布，無(wú)細(xì)胞膜破裂，模型組中線粒體明顯增多，且聚集在一起，線粒體增多可能由于缺氧造成，高膽固醇可能引起心血管堵塞而造成供氧不足；高濃度組中肌纖維排列整齊，且線粒體較高脂組有明顯降低，且均勻分布在肌纖維中；低濃度組中線粒體比較多，分布較雜亂，進(jìn)一步導(dǎo)致了嵴斷裂。

圖1 肝臟組織切片電鏡透視圖（×650 000）Figure1 Transmission electron microscope photos ofrats liver slice

圖2 心臟組織切片電鏡透視圖（×650 000）Figure2 Transmission electron microscope photos ofrats heart slice

3 結(jié)論

同化作用和共沉淀作用是乳酸菌體外降膽固醇水平的兩個(gè)重要機(jī)制［16，17］。而對(duì)體內(nèi)研究應(yīng)從膽固醇在體內(nèi)的代謝平衡角度加以考察，即從膽固醇的合成與降解兩個(gè)方面來(lái)研究。本研究認(rèn)為發(fā)酵乳桿菌能通過促進(jìn)糞便排泄來(lái)降解大鼠體內(nèi)膽固醇的含量。當(dāng)然，與模型組相比，試驗(yàn)菌株的發(fā)酵乳及高濃度菌懸液能顯著降低大鼠的LDL－C、TC、TG水平及AI、AAI指數(shù)和大鼠肝臟的膽固醇含量（P＜0．05），但與對(duì)照組相比，改善效果并不明顯，這可能是由于干預(yù)各組飼料均為高脂飼料，大鼠體內(nèi)膽固醇合成速度大于乳酸菌降解速度；通過電鏡透視還發(fā)現(xiàn)，高濃度的菌懸液能促進(jìn)模型組大鼠心臟肌纖維的整齊排列、線粒體的均勻分布，且肝臟脂肪顆粒幾乎接近對(duì)照組。后續(xù)研究中將重點(diǎn)研究乳酸菌降低血清膽固醇的生化機(jī)理及對(duì)降解途徑的影響。

1 Liong M T，Shah N P．Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains［J］．J．Dairy Sci．，2005，88（1）：55～66．

2 World Health Organization．Cardiovascular disease：technical report of world health organization［R］．Geneva：WHO，2012．

3 Yeo S K，Liong M T．Angiotensin I－converting enzyme inhibitory activity and bioconversion of isoflavones by probiotics in soymilk supplemented with prebiotics［J］．Int．J．Food Sci．Nutr．，2010，61（2）：161～181．

4 Ouwehand A C．Antiallergic effects of probiotics［J］．J．Nutr．，2007，137（3）：794～797．

5 Shaper A G，Kyobe J，Jones K W，et al．Serum lipidsin 3nomadic tribes of northern Kenya［J］．American Journalof Clinical Nutrition，1963，13（3）：135～146．

6 Mann G V，Spoerry A．Studies of a surfactant and cholesteremia in the maasai［J］．American Journal of Clinical Nutrition，1974，27（5）：464～469．

7 Scholz－Ahrens K E，Ade P，Marten B，et al．Prebiotics，probiotics and synbiotics affect mineral absorption，bone mineral content and bone structure［J］．J．Nutr．，2007，137（3）：838～846．

8 Baharav E，Mor F，Halpern M，et al．Lactobacillus GG bacteria ameliorate arthritis in lewis rats［J］．J．Nutr，2004，134（8）：1 964～1 969．

9 Falagas M E，Betsi G I．Probiotics for prevention of recurrent vulvovaginal candidiasis：a review［J］．J．Antimicrob．Chemother，2006，58（2）：266～272．

10 Agerholm－Larsen L，Bell M L，Grunwald G K，et al．The effect of a probiotic milk product on plasma cholesterol：A meta－analysis of short－term intervention studies［J］．European Journal of Clinical Nutrition，2000，54（11）：856～860．

11 嚴(yán)玉婷，潘道東．發(fā)酵乳桿菌SM－7的篩選及對(duì)小鼠降膽固醇作用［J］．食品科學(xué)，2010，31（9）：224～228．

12 鄧正輝，張華，李龍平．生化試劑對(duì)膽汁酸測(cè)定的交叉污染及防范措施［J］．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008（10）：55～56．

13 馬瑞瓊，張書永，張衛(wèi)光，等．實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠膠原網(wǎng)絡(luò)構(gòu)筑的掃描電鏡觀察［J］．解剖學(xué)報(bào)，2004，35（3）：302～305．

14 Oht ani O．The maceration technique in scanning electron microscopy of collagen fiber frameworks：its application in the study of human livers［J］．Arch．Histol．Cytol．，1992，55（Suppl）：225～232．

15 謝寧．兩株乳酸桿菌對(duì)高脂飲食大鼠膽固醇影響及相關(guān)機(jī)制研究［D］．長(zhǎng)沙：中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，2011．

16 Noh D O，Kim S H，Gilliland S E．Incorporation of cholesterol into the cell membrance of Lactobacillus acidophilus ATCC43121［J］．J．Dairy Sci．，1997，80（12）：3 107～3 113．

17 Tannock G M，Tangerman A，Schaik A V，et al．Deconjugation of bile acids by lactobacilli in the mouse small bowel［J］．Appl．Environ．Microbiol，1994，60（9）：3 419～3 420．