田林雙 于 偉 吳存兵 顧鵬程 周琳琨 邱 琳

（江蘇財(cái)經(jīng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院1，淮安 223003）

（江蘇省淮安市科技局2，淮安 223001）

過(guò)氧化苯甲酰（簡(jiǎn)稱BPO）曾作為小麥粉的改良劑和增白劑［1］，在我國(guó)批準(zhǔn)使用多年。鑒于BPO對(duì)小麥粉營(yíng)養(yǎng)和人體健康產(chǎn)生的危害［2］，2011年2月，衛(wèi)生部等七部門聯(lián)合發(fā)文，禁止在小麥粉生產(chǎn)中添加BPO，但仍有小麥粉生產(chǎn)者或經(jīng)營(yíng)者為了追求小麥粉白度，達(dá)到以次充好目的，在小麥粉中違法添加BPO。

小麥粉中BPO含量的檢測(cè)，主要有氧化還原滴定法［3－4］、可見(jiàn)分光光度法［5－7］、熒光分光光度法［2］、氣相色譜法［8－9］、高效液相色譜法［10－12］、化學(xué)發(fā)光法［13－14］和生物傳感器法［15］。上述檢測(cè)方法各有特點(diǎn)，亦存在部分不足。氧化還原滴定法只適用于高含量組分測(cè)定；熒光分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法和化學(xué)發(fā)光法分析時(shí)間長(zhǎng)，需要價(jià)格昂貴的分析儀器，不便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；生物傳感器法中所需要的生物傳感器制作過(guò)程復(fù)雜；可見(jiàn)分光光度法儀器價(jià)格低、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、分析速度快、適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前發(fā)表的BPO可見(jiàn)分光光度法基于的檢測(cè)原理，主要有碘 －淀粉光度法［5－6］和鐵（Ⅱ）－鄰菲啰啉褪色光度法［7］。碘－淀粉光度法中，BPO的提取溶劑乙醇會(huì)影響碘－淀粉的顯色，降低了方法的靈敏度［6］。鐵（Ⅱ）－鄰菲啰啉褪色光度法的線性較差（R2＜0.94），線性范圍小［7］。本研究基于BPO的氧化性，將 Fe2＋氧化成 Fe3＋，生成的 Fe3＋與硫氰酸鹽在酸性乙醇介質(zhì)中發(fā)生顯色，建立一種BPO檢測(cè)新方法，以期實(shí)現(xiàn)BPO的快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，進(jìn)而有效控制BPO在小麥粉中的違法添加。

1 材料與方法

1.1 S材料與試劑

小麥粉樣品（市售）：江蘇淮安。

無(wú)水乙醇、BPO、KSCN、（NH4）2Fe（SO4）2·6H2O、（NH4）Fe（SO4）2·12H2O、HCl（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

UV5100分光光度計(jì)：天津港東科技發(fā)展股份有限公司；HH－8恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 光譜吸收曲線

取4支比色管，試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2加入BPO乙醇溶液，使BPO在比色管中的終濃度分別為5 mg／L和10 mg／L。試驗(yàn)組3和試驗(yàn)組4加入（NH4）Fe（SO4）2·12H2O標(biāo)準(zhǔn)溶液，使 Fe3＋終濃度分別為3 mg／L和 6 mg／L。各 試 驗(yàn) 組 均 加 入 （NH4）2Fe（SO4）2·6H2O、KSCN和稀鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使 Fe2＋、KSCN和HCl在各比色管中的終質(zhì)量濃度分別為10mg／L、3 g／L和 1 mmol／L。控制反應(yīng)介質(zhì)中含乙醇96%。Fe2＋質(zhì)量濃度為10 mg／L、KSCN質(zhì)量濃度為3 g／L、HCl濃度為 1 mmol／L的乙醇溶液為參比溶液。各比色管置于60℃水浴環(huán)境下反應(yīng)10 min，取出，450～550 nm之間進(jìn)行光譜掃描。

1.3.2 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)光譜吸收曲線的影響

在試驗(yàn)組和對(duì)照組比色管中分別加入適量（NH4）2Fe（SO4）2·12H2O溶液、KSCN溶液和 HCl溶液，使各比色管中 Fe2＋終質(zhì)量濃度為10 mg／L，KSCN終質(zhì)量濃度為 3 g／L，HCl終濃度為 1 mmol／L。在試驗(yàn)組比色管中加入BPO乙醇溶液，使BPO終質(zhì)量濃度為4 mg／L。對(duì)照組比色管不加入BPO乙醇溶液。設(shè)定試驗(yàn)組和對(duì)照組比色管乙醇終體積分?jǐn)?shù)分別為 60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、98%。將各比色管置于60℃水浴環(huán)境下反應(yīng)10 min，取出，分別用對(duì)應(yīng)對(duì)照組溶液調(diào)零，450～550 nm之間進(jìn)行光譜掃描。

1.3.3 酸含量對(duì)顯色反應(yīng)影響

配置BPO標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液，質(zhì)量濃度為10 mg／L。配置KSCN標(biāo)準(zhǔn)水溶液，質(zhì)量濃度為300 g／L。配置不同濃度（NH4）2Fe（SO4）2·12H2O和 HCl混合水溶液，F(xiàn)e2＋質(zhì)量濃度固定為 1 000 mg／L，HCl濃度分別為 0、1、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 mmol／L。取5 mL比色管，加入BPO標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液2 mL，KSCN標(biāo)準(zhǔn)水溶液 50μL，不同濃度（NH4）2Fe（SO4）2·12H2O和HCl混合水溶液50μL，無(wú)水乙醇定容至5 mL。最終，各試驗(yàn)組比色管中，BPO、Fe2＋、KSCN終質(zhì)量濃度分別為4 mg／L，10 mg／L和3 g／L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為98%，HCl終濃度分別為0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 mmol／L。將各比色管置于60℃水浴環(huán)境下反應(yīng)10 min，取出，分別用對(duì)應(yīng)對(duì)照組溶液調(diào)零，505 nm下測(cè)定吸光度。

1.3.4顯色反應(yīng)溫度對(duì)顯色反應(yīng)影響

各比色管中，HCl終濃度為 2 mmol／L，BPO、Fe2＋、KSCN終質(zhì)量濃度分別為4 mg／L，10 mg／L和3 g／L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 98%，溶液配制方法參照1.3.3。將比色管分別置于 20、30、40、50、60、70、80、90、100℃水浴環(huán)境下反應(yīng)10 min，取出，按照1.3.3方法測(cè)定吸光度。

1.3.5 顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)影響

比色管中各組分濃度同1.3.4，將各比色管置于50℃水浴環(huán)境下，分別反應(yīng) 0、2、5、10、15、20、30、60 min。取出，按照1.3.3方法測(cè)定吸光度。

1.3.6 反應(yīng)介質(zhì)中Fe2＋濃度對(duì)顯色反應(yīng)影響

各比色管中，F(xiàn)e2＋終質(zhì)量濃度分別為 0、1、2、4、6、10、15、20、30、50 mg／L。其余組分濃度同 1.3.4。將比色管置于50℃水浴環(huán)境下反應(yīng)15 min，取出，按照1.3.3方法測(cè)定吸光度。

1.3.7 反應(yīng)介質(zhì)中KSCN質(zhì)量濃度對(duì)顯色反應(yīng)影響

各比色管中，F(xiàn)e2＋質(zhì)量終濃度為 15 mg／L，KSCN終質(zhì)量濃度分別為 0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5、3、6、10 g／L。其余組分濃度同1.3.4，按照1.3.3方法測(cè)定吸光度。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別配置 0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、15 mg／L的BPO無(wú)水乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照最佳試驗(yàn)條件，用空白試劑做參比，測(cè)定各溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.9 小麥粉中BPO的提取

定量稱取0.1～1.0 g小麥粉于表面皿中，干燥器常溫干燥12 h后，倒入25 mL離心管中，加入無(wú)水乙醇10 mL，超聲提取5 min，離心，獲得上清液5 mL，按照最佳試驗(yàn)條件，測(cè)定BPO含量。

1.3.10 共存物質(zhì)干擾

向反應(yīng)體系中，分別加入 Na＋、K＋、Sr2＋、Ag＋、Mg2＋、NH4＋、Ba2＋、Cl－、NO3－、Mo（V）和 W（V）標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制反應(yīng)體系中，乙醇體積分?jǐn)?shù)98%，BPO、HCl、Fe2＋、KSCN濃度分別為 2 mg／L、2 mmol／L、15 mg／L和3 g／L。按照1.3.8方法，測(cè)定BPO含量。

1.3.11 樣品分析

取6份市售小麥粉樣品，按照1.3.9方法，提取小麥粉中BPO，按照最佳試驗(yàn)條件，進(jìn)行樣品分析及回收率試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2003及SPSS 13.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜吸收曲線

光譜吸收試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，4個(gè)試驗(yàn)組光譜吸收曲線走向相似，說(shuō)明存在于試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組2中的 BPO，的確能夠氧化 Fe2＋成 Fe3＋，F(xiàn)e3＋再與KSCN發(fā)生顯色反應(yīng)。試驗(yàn)組1與試驗(yàn)組2較，BPO質(zhì)量濃度為10 mg／L的試驗(yàn)組2吸光度大于BPO質(zhì)量濃度為5 mg／L的試驗(yàn)組1吸光度，提示若建立吸光度與BPO濃度的定量關(guān)系，則可以通過(guò)檢測(cè)顯色反應(yīng)產(chǎn)物的方法間接測(cè)定BPO。

圖1 400～600 nm之間各試驗(yàn)組光譜吸收曲線

2.2 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)光譜吸收曲線影響

本研究預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)介質(zhì)中，乙醇的含量影響有色配合物的顯色行為，有必要設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究不同乙醇含量對(duì)顯色反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果（圖2）表明，反應(yīng)介質(zhì)中乙醇含量極大的影響配合物的顯色，乙醇含量越高，實(shí)驗(yàn)組比色管內(nèi)溶液顏色越深，吸光度越大。張東等［6］在研究碘－淀粉光度法測(cè)定BPO時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)乙醇含量影響碘－淀粉配合物的顯色，所不同的是碘－淀粉光度法，高含量的乙醇降低BPO檢測(cè)的靈敏度。而本研究中，高含量的乙醇提高了BPO檢測(cè)的靈敏度。

本研究確定乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)為98%，之所以不研究更高的乙醇含量對(duì)光譜吸收曲線的影響，是因?yàn)榉磻?yīng)體系中Fe2＋、KSCN和HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的加入，會(huì)帶入少量的水。

圖2 反應(yīng)介質(zhì)中乙醇含量對(duì)配合物光譜吸收曲線的影響

2.3 酸含量對(duì)顯色反應(yīng)影響

根據(jù)2.1，2.2試驗(yàn)結(jié)果，研究在98%乙醇作為反應(yīng)介質(zhì)、測(cè)量波長(zhǎng)為505 nm的條件下，反應(yīng)介質(zhì)中酸含量對(duì)顯色反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，當(dāng)反應(yīng)介質(zhì)中 HCl濃度從0.2 mmol／L增加到2 mmol／L，吸光度隨著酸濃度的增加而增加。當(dāng)反應(yīng)體系中酸濃度大于5 mmol／L時(shí)，對(duì)照組和試驗(yàn)組比色管均出現(xiàn)渾濁，推測(cè)原因是高濃度的酸影響了KSCN或Fe2＋在反應(yīng)體系中的溶解，因此確定HCl最佳濃度為 2 mmol／L。

圖3 反應(yīng)介質(zhì)中酸濃度對(duì)吸光度的影響

2.4 顯色反應(yīng)溫度對(duì)顯色反應(yīng)影響

研究在98%乙醇作為反應(yīng)介質(zhì)、測(cè)量波長(zhǎng)為505 nm、HCl濃度為2 mmol／L的條件下，反應(yīng)溫度對(duì)顯色反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，反應(yīng)溫度從20℃增加到50℃，吸光度隨顯色反應(yīng)溫度的提高而增加，大于60℃之后，吸光度變化較少。確定最佳顯色反應(yīng)溫度為50℃。

圖4 顯色反應(yīng)溫度對(duì)顯色反應(yīng)影響

2.5 顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)影響

研究在98%乙醇作為反應(yīng)介質(zhì)、測(cè)量波長(zhǎng)為505 nm、HCl濃度為2 mmol／L、反應(yīng)溫度為50℃的條件下，顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果（圖5）表明，反應(yīng)時(shí)間從0 min增加到10 min時(shí)，吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，大于10 min之后，吸光度變化趨于平緩。確定最佳顯色反應(yīng)時(shí)間為15 min。

圖5 顯色反應(yīng)時(shí)間對(duì)顯色反應(yīng)影響

2.6 反應(yīng)介質(zhì)中Fe2＋濃度對(duì)顯色反應(yīng)影響

研究在98%乙醇作為反應(yīng)介質(zhì)、測(cè)量波長(zhǎng)為505 nm、HCl濃度為2 mmol／L、反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時(shí)間為15 min的條件下，F(xiàn)e2＋濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，反應(yīng)介質(zhì)中Fe2＋質(zhì)量濃度從0 mg／L增加到10 mg／L，吸光度隨著 Fe2＋濃度增加而增加，當(dāng)Fe2＋質(zhì)量濃度大于10 mg／L時(shí)，吸光度變化不大，說(shuō)明此時(shí)Fe2＋濃度對(duì)顯色反應(yīng)影響較小。確定反應(yīng)介質(zhì)中Fe2＋最佳濃度為15 mg／L。

圖6 反應(yīng)介質(zhì)中Fe2＋濃度對(duì)顯色反應(yīng)影響

2.7 反應(yīng)介質(zhì)中KSCN濃度對(duì)顯色反應(yīng)影響

研究在98%乙醇作為反應(yīng)介質(zhì)、測(cè)量波長(zhǎng)為505 nm、HCl濃度為2 mmol／L、反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時(shí)間為15 min、Fe2＋質(zhì)量濃度為 15 mg／L的條件下，KSCN濃度對(duì)顯色反應(yīng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明，反應(yīng)介質(zhì)中KSCN質(zhì)量濃度從0 g／L增加到1 g／L，吸光度隨著KSCN濃度增加而增加，當(dāng)KSCN質(zhì)量濃度大于1 g／L時(shí)，吸光度變化不大，說(shuō)明此時(shí)KSCN濃度對(duì)顯色反應(yīng)影響較小。確定反應(yīng)介質(zhì)中KSCN最佳質(zhì)量濃度為3 g／L。

圖7 反應(yīng)介質(zhì)中KSCN濃度對(duì)顯色反應(yīng)影響

2.8 共存物質(zhì)干擾試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果表明，BPO含量相對(duì)誤差在5%之內(nèi)時(shí)，十倍的 Na＋、K＋、Sr2＋、Ag＋、Mg2＋、NH4＋、Ba2＋、Cl－、NO3－對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，等量的 Mo（V），W（V）干擾測(cè)定。而小麥粉中Mo（V）、W（V）天然含量

較少，所以此方法抗干擾能力強(qiáng)。

2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳的試驗(yàn)條件為：顯色反應(yīng)在乙醇介質(zhì)中進(jìn)行，乙醇含量為98%，測(cè)量波長(zhǎng)為505 nm，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為15 min。反應(yīng)介質(zhì)中 HCl、Fe2＋和 KSCN的濃度為別為 2 mmol／L、15 mg／L和 3 g／L。標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)結(jié)果（圖8）表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 4，高于其他已發(fā)表的、利用可見(jiàn)分光光度計(jì)的 BPO檢測(cè)方法［6－7］。經(jīng)過(guò)換算，BPO表觀摩爾吸光系數(shù) ε＝2.136 5×104L·mol－1·cm－1，檢出限為 0.025 mg／L。BPO濃度在0.1～15 mg／L范圍內(nèi)符合朗伯－比爾定律，BPO最大濃度為最小濃度的150倍，線性范圍大于其他已發(fā)表的、利用可見(jiàn)分光光度計(jì)的BPO檢測(cè)方法［6－7］。

圖8 BPO標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.10 樣品分析及回收試驗(yàn)

最佳試驗(yàn)條件下，進(jìn)行BPO樣品分析和回收率試驗(yàn)，結(jié)果（表1）表明，本方法樣品測(cè)定回收率在97.2%～104.4%之間。

表1 市售小麥粉樣品分析結(jié)果及回收率（n＝6）

3 結(jié)論

本研究建立一種BPO檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行試驗(yàn)條件研究，包括光譜吸收曲線、反應(yīng)介質(zhì)、酸含量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、Fe2＋濃度、KSCN濃度、共存干擾物質(zhì)等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。確定的最佳試驗(yàn)條件為：顯色反應(yīng)在乙醇介質(zhì)中進(jìn)行，乙醇含量為98%，測(cè)量波長(zhǎng)為505 nm，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為15 min。反應(yīng)介質(zhì)中HCl、Fe2＋和KSCN的濃度為別為2 mmol／L、15 mg／L和3 g／L。最佳試驗(yàn)條件下，本方法測(cè)定BPO的線性范圍為0.1～15 mg／L，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.088 2x＋0.029 9，相關(guān)系數(shù) R2＝0.999 4，505 nm處表觀摩爾吸光系數(shù) ε＝2.136 5×104L·mol－1·cm－1，檢出限0.025 mg／L。利用該方法對(duì)市售小麥粉樣品進(jìn)行測(cè)定，回收率在97.2%～104.4%之間。

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