徐 飛 初 眾 谷風(fēng)林 譚樂和 盧少芳 趙建平

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所國家熱帶重要作物工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，萬寧 571533）

香草蘭（Vanilla planifolia Andrews）是熱帶多年生大型肉質(zhì)藤本攀援植物，素有“食品香料之王”的美譽(yù)，是我國重要的熱帶香薰作物之一［1］。原產(chǎn)于南美洲的墨西哥，現(xiàn)廣泛種植于南、北緯20°之間的熱帶地區(qū)，種植國家涉及馬達(dá)加斯加、科摩羅、留尼汪等國，總種植面積達(dá)3.3萬～3.5萬hm2。世界年總產(chǎn)量約2 500 t左右，總產(chǎn)值達(dá)100多億元，在世界熱帶農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)、國際貿(mào)易和人類生活中具有極其重要的作用。目前主要在海南、云南地區(qū)有加工，其加工需要經(jīng)過清洗、發(fā)酵、干燥、陳化達(dá)4～6月以上才能具有濃郁的香味，豆莢經(jīng)加工后的初產(chǎn)品香蘭莢，俗稱香蘭豆，含有250多種揮發(fā)性香氣成分。豆莢提取物為香草蘭凈油，具有沁人心脾的獨(dú)特香氣，廣泛應(yīng)用于調(diào)制高級(jí)香煙、名酒、各類糕點(diǎn)、化妝品等。此外，它還具有強(qiáng)心、補(bǔ)腦、健胃等藥效［2］。

香草蘭凈油中主要香氣成分為香蘭素，而目前在國內(nèi)外大部分食品、化妝品添加的為化學(xué)合成的香蘭素，化學(xué)合成的香蘭素大劑量可導(dǎo)致頭痛、惡心、嘔吐等癥狀，因此天然香蘭素的提取能較好的解決以上問題。傳統(tǒng)提取香草蘭凈油的方法主要有：溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法、程序增壓萃取法等。但一般的有機(jī)溶劑浸提方法提取率較低，提取時(shí)間較長，而超臨界CO2萃取方法與程序增壓萃取法成本較高，因此本課題通過研究在不同的時(shí)間纖維素酶酶解作為預(yù)處理，結(jié)合溶劑萃取方法萃取香草蘭凈油，對(duì)所得的香草蘭凈油利用GC－MS分析其組分及其相對(duì)含量。為進(jìn)一步制作香草蘭高級(jí)調(diào)味品、化妝品提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

香草蘭由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供，采收成熟后的香草蘭豆莢經(jīng)殺青、發(fā)酵、干燥、陳化生香后低溫烘干，粉碎，過40目篩，得香草蘭干粉，備用。纖維素酶（Cellulase，綠色木酶，酶活力＞15 u／mg）：上海伯奧生物科技有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

7890AGC－5975CMS氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國 Agilent公司；HS－100型自動(dòng)進(jìn)樣器：瑞士 CTC公司；Z36HK型超速冷凍離心機(jī)：德國 Hermle；IKAWERKE磁力攪拌器：德國IKA公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司。

1.3 香草蘭凈油提取方法

根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)到的方法略作修改［3］，稱取香草蘭干粉10 g（含水率12.4%）置于錐形瓶中，加入50 mL 0.2 mol／L pH＝4.8醋酸－醋酸鈉緩沖溶液（其1 000 mL醋酸－醋酸鈉緩沖液中溶解酶量0.5 g）。酶解溫度保持在45℃，磁力攪拌下酶解，酶解一定時(shí)間后加入一定量的乙醇，攪拌浸提過夜。所得浸提液過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直到乙醇溶液不再蒸出得到褐色浸膏，加入70℃熱乙醇在－10℃以下冷凍3 h后過濾除去油樹脂，再次蒸發(fā)到無乙醇流出為止，收集得到凈油。所得凈油加入2 mL乙醇和4 mL正己烷溶解后加少量無水硫酸鈉除去水分，離心（6 000 r／min，15 min）。樣品進(jìn)行 GC－MS分析。

1.4 香草蘭凈油成分的GC－MS分析方法

GC／MS條件：進(jìn)樣口溫度是270℃；柱初始溫80℃，保持2 min，以10℃／min升溫至160℃，然后以5℃／min程序升溫到270℃，并保持50 min。載氣為氦氣；流量1.2 mL／min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1μL。毛細(xì)管柱：HP－5MS（Agilent19091S－433）30.0 m×250.0μm×0.25μm。質(zhì)譜條件：離子源為EI源模式，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度為250℃，接口溫度280℃，掃描范圍：40～450 amu。色譜庫NIST08。積分開始時(shí)間為3.5 min，以避免溶劑峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解時(shí)間香草蘭凈油色譜圖

不同酶解時(shí)間條件下預(yù)處理后乙醇萃取香草蘭凈油色譜圖見圖1，由圖1可見，6 h酶解得到的化合物種類較多，且在不同的酶解時(shí)間下同一保留時(shí)間凈油中主要化學(xué)成分較為相似［4］。隨著時(shí)間的延長，其化合物種類逐漸的減少，可能由于在高溫下，易揮發(fā)性的香味物質(zhì)容易散失［5－6］，因此想要得到較多的化學(xué)物質(zhì)選擇合適的酶解時(shí)間比較關(guān)鍵。因?yàn)樵囼?yàn)是利用不同時(shí)間酶解后，再用乙醇萃取分級(jí)提純得到凈油，且植物中纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)14.7%，故選用纖維素酶酶解，酶解時(shí)間的不同直接關(guān)系到成分變化的狀況。

圖1 不同酶解時(shí)間后萃取得到的香草蘭凈油色譜圖

2.2 同酶解時(shí)間香草蘭凈油GC－MS分析

通過GC／MS圖譜掃描，利用手動(dòng)積分模式對(duì)各物質(zhì)進(jìn)行積分，將峰面積表示其含量，做y軸，用不同酶解時(shí)間作為x軸，表示香草蘭凈油中風(fēng)味物質(zhì)在不同酶解時(shí)間過程中含量變化趨勢(shì)，各組樣品中各物質(zhì)峰面積累加，通過各物質(zhì)峰面積之和變化，可以看出香草蘭凈油在不同酶解過程中其組分發(fā)生不同程度的變化，具體趨勢(shì)見圖2。

圖2 不同酶解時(shí)間得到的香草蘭凈油峰面積變化

從圖2中可以看出，香草蘭在酶解6 h時(shí)其峰面積總和達(dá)到最高，之后隨著時(shí)間的延長，物質(zhì)含量逐漸下降，這可能是由于纖維素酶在酶解纖維時(shí)，其新物質(zhì)產(chǎn)生的同時(shí)也存在一定的揮發(fā)性散失，當(dāng)物質(zhì)含量達(dá)到最大時(shí)，隨著時(shí)間的延長其物質(zhì)散失速度越快，因此在時(shí)間最長9 h的情況下得到的物質(zhì)峰面積含量最少。

2.3 不同酶解時(shí)間下各物質(zhì)檢出數(shù)量

不同酶解時(shí)間下的各樣品，經(jīng)過正己烷萃取，添加無水硫酸鈉去除所含水分，低溫超速離心等工藝，利用GC／MS掃描分析，在30～450 amu的掃描范圍下，采用自動(dòng)積分模式，并用手動(dòng)積分模式修正自動(dòng)積分中存在的明顯錯(cuò)誤，各樣品掃描出風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量見圖3。

圖3 不同酶解時(shí)間下各物質(zhì)檢出比較

酶解不同時(shí)間做預(yù)處理，溶劑萃取的凈油檢出化合物數(shù)量比較，發(fā)現(xiàn)在6 h時(shí)檢查化合物數(shù)量最多，即表示在酶解6 h時(shí)香草蘭凈油中含量較多的風(fēng)味物質(zhì)，但是隨著時(shí)間的延長凈油中化合物逐漸減少，表明酶解時(shí)間越長，揮發(fā)性物質(zhì)損失越多，幾乎減少一半，說明香草蘭凈油中易揮發(fā)香氣物質(zhì)較多。因此，選擇合適的酶解時(shí)間能更好的得到香味濃郁的凈油。

2.4 不同酶解時(shí)間下峰面積比較及香蘭素相對(duì)含量

香蘭素是香草蘭中主要香氣物質(zhì)之一，從圖4可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，香蘭素含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。而各時(shí)間下其峰面積總和卻是在6 h之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說明雖然隨著酶解時(shí)間的延長，其物質(zhì)含量有所減少，但是酶解時(shí)間對(duì)香蘭素影響不大。

圖4 不同酶解時(shí)間下峰面積比較及香蘭素相對(duì)含量

2.5 不同時(shí)間酶解下主要化合物及相對(duì)含量

各凈油樣品經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索、人工解析及與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對(duì)照，選出其中主要的14種風(fēng)味成分。以面積歸一化法測(cè)定其相對(duì)含量［7－8］，結(jié)果見表1。

從表1中可以看出，不同酶解時(shí)間作為預(yù)處理，其他條件相同萃取得到的香草蘭凈油在相同保留時(shí)間下所含組分基本相同，選擇了5種不同時(shí)間下相對(duì)含量較多的14種化合物成分進(jìn)行分析，得到醛類：香蘭素、環(huán)丙基甲醛，相對(duì)含量在8～9 h時(shí)相對(duì)含量較高；酸類：正十六酸、亞油酸，酸類在5 h時(shí)相對(duì)含量較高；酯類：正十六酸乙酯、亞油酸乙酯、1，2－苯二甲酸單（2－乙己基）酯、16－甲氧基－14－氧化十六碳－15烯酸甲酯、噻吩－2－甲酸－4甲基戊基酯；酯類物質(zhì)沒有統(tǒng)一的酶解時(shí)間，不同的時(shí)間下不同的物質(zhì)相對(duì)含量具有一定的差別；烷烴類：十四烷基環(huán)辛烷；烷烴類在9 h時(shí)相對(duì)含量較高；醇類：蕓苔甾醇；醇類在6 h時(shí)相對(duì)含量較高；雜環(huán)類：2，4－二羥基吡啶；雜環(huán)類在8 h時(shí)相對(duì)含量較高；酮類：2－噻酚環(huán)丙基甲酮、2，4－噻唑烷二酮。酮類在6 h時(shí)相對(duì)含量較高。利用不同酶解時(shí)間作為預(yù)處理，其他條件相同萃取得到的香草蘭凈油相同保留時(shí)間下所含組分基本相同，其中這14種化合物為香草蘭凈油中的主要化學(xué)組分，其相對(duì)含量占總含量的50%以上。但是不同的酶解時(shí)間下相對(duì)含量相差較大。

表1 不同酶解時(shí)間下香草蘭凈油風(fēng)味物質(zhì)及相對(duì)含量比較

本試驗(yàn)是應(yīng)用酶法冷浸出法提油工藝，主要利用酶類對(duì)油料細(xì)胞的降解作用使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞而有利于油的提取，由于酶解條件溫和、溫度較低，因而不僅能耗明顯低于傳統(tǒng)方法，更主要的是油料中蛋白質(zhì)等成分性能能很好的保持，達(dá)到同時(shí)利用油脂和蛋白質(zhì)等有效成分的目的，油料不經(jīng)高溫處理，所提油脂的品質(zhì)明顯提高，得油率也高；另外，油料中存在脂蛋白和脂多糖，不僅阻礙油脂的提取，而且這些復(fù)合物本身會(huì)對(duì)油分子起包埋作用，傳統(tǒng)的熱處理難以打破這種包埋，而通過酶法能降解復(fù)合物，釋放油脂；應(yīng)用酶法還能解決油脂提取常規(guī)方法中的乳化問題，破壞其中起兩性作用的物質(zhì)［9］。如蛋白、果膠、磷脂等，使得主要成分保持較好，但所需酶量較大，必須考慮經(jīng)濟(jì)上切實(shí)可行，使用產(chǎn)量大、價(jià)格低的酶種是以后發(fā)展的趨勢(shì)。

3 結(jié)論

3.1 采用纖維素酶酶解作為預(yù)處理，溶劑法萃取香草蘭凈油，改變酶解時(shí)間，其他條件相同時(shí)，所得到的5種香草蘭凈油進(jìn)行GC－MS分析，5種香草蘭凈油在同一保留時(shí)間下組成成分基本一致。香草蘭凈油中含量最高的14種主要成分分別為：香蘭素；正十六酸、正十六酸乙酯、亞油酸、亞油酸乙酯、1，2－苯二甲酸單（2－乙己基）酯、16－甲氧基－14－氧化十六碳－15烯酸甲酯、2－噻酚環(huán)丙基甲酮、2，4－二羥基吡啶、2，4－噻唑烷二酮、噻吩－2－甲酸－4甲基戊基酯、十四烷基環(huán)辛烷、蕓苔甾醇、環(huán)丙基甲醛。

3.2 在不同酶解時(shí)間作為預(yù)處理，其他條件相同萃取得到的香草蘭凈油在相同保留時(shí)間下所含組分基本相同，其中這14種化合物為香草蘭凈油中的主要化學(xué)組分，其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%以上。但是在不同的酶解時(shí)間下相對(duì)含量相差較大。

3.3 酶法具有條件溫和、溫度較低，不經(jīng)高溫處理，所提油脂的品質(zhì)較高；另外，能降解復(fù)合物、釋放油脂、解決油脂提取常規(guī)方法中的乳化問題，破壞其中起兩性作用的物質(zhì)如蛋白、果膠、磷脂等，使得主要成分保持較好，但所需酶量較大，必須考慮經(jīng)濟(jì)上切實(shí)可行，使用產(chǎn)量大、價(jià)格低的酶種是以后發(fā)展的趨勢(shì)。

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