劉 禹 段江蓮 李為琴 張梅慶 琚裕杰

(山西師范大學(xué)食品科學(xué)與工程系1，臨汾 041004)(臨汾市堯都區(qū)教育局2，臨汾 041004)

高粱(Sorghum bicolor(L.)Moench)屬禾本科高粱屬一年生草本植物，具有光合效率高、抗逆性強(qiáng)、雜種優(yōu)勢(shì)突出、用途廣泛等特點(diǎn)［1］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，高粱中除含有豐富的單寧多酚成分外，還含有酚酸、原花青素、類黃酮等多種酚類化合物［2－3］，這些化合物具有較好的抗氧化活性［2，4］。劉睿等［5］對(duì)高粱外種皮的原花青素進(jìn)行了分離、純化和抗氧化方面的研究，發(fā)現(xiàn)不同提取劑對(duì)高粱原花青素的提取率有較大的差異;王華等［6］研究了高粱籽粒的甲醇和水提取物的抗氧化活性;張國(guó)濤等［7］研究了不同果皮顏色高粱甲醇提取物的抗氧化活性。這些研究主要以高粱甲醇、乙醇、水提取物為主，并未全面反映高粱籽粒不同溶劑提取物的抗氧化活性。研究結(jié)果表明，由于提取溶劑的不同，會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果上存在一定的差異［5，8－9］。本試驗(yàn)研究了甲醇、80% 甲醇、乙醇、80%乙醇、丙酮、80%丙酮、正己烷、乙酸乙酯、水等不同極性的溶劑對(duì)高粱植物化學(xué)成分含量及其抗氧化活性的影響，旨在為建立一種有效評(píng)價(jià)高粱抗氧化能力的方法及高粱米的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑

脫皮高粱米:農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng);沒(méi)食子酸(GA)、蘆丁、1，1－苯基 －2－苦肼基自由基(DPPH)、2，2－聯(lián)氮－3－乙苯－二噻唑－6磺酸(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox):sigma公司;Fe3+－三吡啶三吖嗪(TPTZ):Fluka公司;福林酚試劑:西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;其他藥品和試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU－1900紫外分光光度計(jì):北京普析通用有限公司;5840R冷凍離心機(jī):Gene公司;SC－5A超級(jí)恒溫槽:上海比朗儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將高梁米粉碎，過(guò)40目篩。準(zhǔn)確稱取高粱米粉末2.0 g，放入錐形瓶中。按1∶20料液比分別加入甲醇、80%甲醇、乙醇、80%乙醇、丙酮、80%丙酮、正己烷、乙酸乙酯、水，在30℃水浴振蕩器中浸提1 h。然后在4℃、6 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用甲醇定容到10 mL，制備所得樣品在4℃冰箱中保存，用于樣品分析和測(cè)定。

1.3.2 多酚含量測(cè)定

多酚含量測(cè)定采用Folin－Ciocalteu測(cè)定法［10］。取0.1 mL樣品提取液于試管中，加入2.8 mL蒸餾水和0.1 mL 1.0 mol/L Folin－Ciocalteu 試劑，混合均勻，靜止8 min后加入2 mL 7.5% 碳酸鈉溶液，搖勻，混合液密封室溫下置于避光處，2 h后于765 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，平行測(cè)定3次，以甲醇做空白，沒(méi)食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的回歸方程為:y=0.002 8x+0.003 5(0 ～200 μg/mL，R2=0.998 9)，式中:y為吸光度值，x為沒(méi)食子酸濃度(μg/mL)。不同提取物中多酚含量以每克干燥樣品中所含的相當(dāng)于沒(méi)食子酸的量進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3 總黃酮含量測(cè)定

精確量取1 mL樣品提取液于10 mL的容量瓶中，先加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，再加入0.3 mL的10%的硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，然后加4 mL 4%的氫氧化鈉溶液，分別用蒸餾水稀釋至刻度，靜置15～20 min，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光值，平行測(cè)定3次，以蒸餾水作為空白，蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的回歸方程為:y=0.011 6x+0.015 1(0～64 μg/mL，R2=0.997 5)，式中:y為吸光度值，x為蘆丁濃度(μg/mL)。不同提取物中總黃酮含量以每克干燥樣品中所含的相當(dāng)于蘆丁的含量進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 DPPH 自由基清除能力測(cè)定［10］

取0.5 mL適當(dāng)濃度樣品溶液和4.5 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，充分混勻后于室溫下密封避光靜置30 min，以甲醇做空白，于517 nm下測(cè)吸光值。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下:DPPH清除率=100% ×(A0－A1)/A0，式中:A0為對(duì)照管的吸光度值;A1為樣品管的吸光度值。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立的回歸方程為:y=0.717 3x－1.96(0～140 μmol，R2=0.999 8)，式中:y為清除率;x為 Trolox的濃度(μmol)。樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力以每克樣品相當(dāng)于Trolox的微摩爾數(shù)來(lái)表示。

1.3.5 ABTS 自由基清除能力測(cè)定［11］

使用前將濃度為7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液混合，室溫避光放置16～24 h，制得ABTS+自由基溶液。用甲醇稀釋，制得在734 nm處吸光度為0.700±0.050的應(yīng)用液。移取50 μL樣品溶液，加入1.9 mL的ABTS+應(yīng)用液，混合，室溫下避光反應(yīng)6 min，立即測(cè)定其在734 nm處吸光度。ABTS自由基清除率計(jì)算公式為:ABTS+清除率=(A0－A1)/A0×100%，式中:A0為空白管的吸光度值，A1為樣品管的吸光度值。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線，ABTS自由基清除能力以每克樣品相當(dāng)于Trolox的微摩爾數(shù)表示。

1.3.6 鐵還原能力(FRAP)測(cè)定［11］

取0.1 mL提取液，加入3.1 mL蒸餾水和新鮮配置的預(yù)熱37℃的1.8 mL TPTZ工作液(由Ph3.6的300 mmol/L醋酸鹽緩沖液，10 mmol/L溶解在40 mmol/L HCl中的TPTZ溶液，20 mmol/L氯化鐵溶液按10∶1∶1體積比混合組成)，混勻后在37℃條件下水浴反應(yīng)30 min，593 nm處測(cè)定吸光度。以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品的鐵還原能力以每克樣品相當(dāng)于FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。建立的回歸方程:y=0.000 3x－0.008 4(100～100 0 μmol/L，R2=0.996 2)，式中:y為吸光度值;x為FeSO4的濃度(μmol)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel處理、DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析和線性回歸分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱米不同溶劑提取物中總多酚及黃酮含量

高粱米不同溶劑提取物中總多酚及黃酮的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，用不同組成的溶劑提取高粱米多酚和黃酮物質(zhì)時(shí)，其得率均存在顯著性差異。高粱不同溶劑提取液中的總酚含量范圍1.30～6.49 mg GA/g。其中80%丙酮與80%甲醇提取液中總酚含量較高，分別為6.49 mg GA/g和6.15 mg GA/g，其次多酚含量由高到低依次為80%乙醇＞丙酮＞甲醇＞乙醇＞蒸餾水＞乙酸乙酯＞正己烷，正己烷提取液中的總酚含量最低(1.30 mg GA/g)，大約是80%丙酮提取液總酚含量的1/5。高粱不同溶劑提取液中的總黃酮含量范圍9.6～61.2 mg/100 g。其中80%丙酮提取液中總黃酮含量最高，為61.2 mg/100 g，其次黃酮含量由高到低依次為:丙酮＞80%乙醇＞80%甲醇＞乙醇＞甲醇＞蒸餾水＞乙酸乙酯＞正己烷，正己烷提取液的黃酮含量最低，為9.6 mg/100 g。這些結(jié)果說(shuō)明不同提取劑由于極性、分散性等性質(zhì)的差異對(duì)多酚、黃酮等植物化學(xué)成分的提取具有選擇性，80%丙酮能有效地提取高粱米中的植物化學(xué)成分。Zielinski等［12］也報(bào)道80%丙酮是一種從谷物中提取多酚和黃酮成分的有效提取劑，這支持了目前的研究結(jié)果。

表1 高粱米不同溶劑提取物中總多酚及黃酮含量

2.2 不同提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

高粱米不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力的研究結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 高粱米不同溶劑提取物的抗氧化能力

由表2可以看出，不同溶劑提取的高粱米提取物清除DPPH自由基能力存在顯著性差異，其中以體積分?jǐn)?shù)80%丙酮的清除率最高，為0.74μmol Trolox/g，說(shuō)明80%丙酮對(duì)高粱米中具有降低羥自由基、烷自由基或過(guò)氧化物自由基有效濃度及打斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈作用的成分提取效果較好。其次為體積分?jǐn)?shù)80%甲醇和80%乙醇(二者無(wú)顯著性差異)，甲醇、丙酮、乙醇、蒸餾水提取物清除DPPH自由基的能力均明顯低于80%甲醇和80%乙醇(P＜0.05)，但它們相互之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05);乙酸乙酯和正己烷提取物清除DPPH自由基的效果最差，清除能力分別為 0.09、0.07 μmol Trolox/g。

2.3 多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

高粱米不同溶劑提取物中多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，高粱米提取物多酚含量與抗氧化能力具有極顯著的高度正相關(guān)性(P＜0.01，0.843甘共苦9＜r＜0.951 3);黃酮含量與清除DPPH自由基能力也具有極顯著的高度正相關(guān)性(P ＜0.01，r=0.807 8)，與清除ABTS自由基能力和鐵還原能力沒(méi)有顯著的相關(guān)性(P ＞0.05，r=0.526 5、0.548 9)。

2.4 不同提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力

高粱米不同溶劑提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力的研究結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，與DPPH試驗(yàn)結(jié)果不同，80%丙酮、80%甲醇和80%乙醇的提取物清除 ABTS自由基的能力較強(qiáng)(4.20～4.52 μmol Trolox/g)，這可能是由于三種提取液的多酚等有效成分構(gòu)成對(duì)ABTS自由基有良好的選擇性;其次清除ABTS自由基能力由高到低依次為蒸餾水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞正己烷＞乙酸乙酯，其中正己烷和乙酸乙酯提取物的清除能力分別為0.51μmol Trolox/g和0.49 μmol Trolox/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他溶劑提取物。楊紅葉等［13］在研究苦蕎提取液抗氧化性能的試驗(yàn)中也得到了相似的結(jié)果。

2.5 不同提取物的鐵還原能力

高粱米不同溶劑提取物的鐵還原能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出，80%丙酮提取物的鐵還原能力最強(qiáng)(6.12μmol Fe(Ⅱ)/g)，還原能力強(qiáng)弱順序依次為80%乙醇＞80%甲醇＞甲醇＞水＞乙醇＞乙酸乙酯＞丙酮＞正己烷，正己烷提取物的鐵還原能力最弱，為2.21μmol Fe(Ⅱ)/g。從3個(gè)抗氧化試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，80%丙酮、80%甲醇和80%乙醇的提取物表現(xiàn)出較高的抗氧化能力，正己烷提取物的抗氧化能力最弱，而其他溶劑提取物由于試驗(yàn)體系的差異而表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。這些不同提取物抗氧化能力的差異主要來(lái)自于不同溶劑導(dǎo)致的高粱提取物中抗氧化物質(zhì)的量和種類所存在的差異。

表3 多酚、黃酮含量與各抗氧化活性的相關(guān)性

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同溶劑對(duì)高粱米提取物中的多酚、黃酮含量及其抗氧化活性有顯著性的影響。80%丙酮提取物中的多酚、黃酮含量最高，分別為6.49 mg GA/g 和 61.2 mg/100 g，其表現(xiàn)出較好的抗氧化能力，清除 DPPH、ABTS自由基的能力分別為0.74、4.52 μmol Trolox/g，鐵還 原 能 力 為 6.12 μmol Fe(Ⅱ)/g;其次80%甲醇和80%乙醇高粱提取物也具有較好的抗氧化能力，正己烷提取物中的多酚、黃酮含量較低，抗氧化能力較差。相關(guān)性分析表明，提取物中的多酚、黃酮含量與其抗氧化能力有較高的相關(guān)性，說(shuō)明不同提取物抗氧化能力的差異主要來(lái)源于提取物中抗氧化物質(zhì)的量的差異。因此，從試驗(yàn)結(jié)果上來(lái)看，80%丙酮是提取高粱米抗氧化物質(zhì)的有效溶劑，但從安全和環(huán)保方面考慮，在實(shí)際應(yīng)用中建議采用80%甲醇和80%乙醇提取高粱米抗氧化物質(zhì)更為合適。

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