陳梅梅 袁 磊 高 梅 劉曉庚施榮華 朱 洵 解海龍 苗紅瑩

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)圖書館室1，南京 210046）

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院2，南京 210046）

（江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，南京 210046）

離子液體是在室溫或接近室溫下以液體狀態(tài)存在的有機(jī)熔融鹽，它完全由離子組成［1］，其具有不易揮發(fā)、穩(wěn)定性高、溶解能力強(qiáng)、功能可調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用領(lǐng)域從開始的化學(xué)合成發(fā)展到今天的材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、分析測(cè)試、生物催化等領(lǐng)域［2－4］。

已有不少文獻(xiàn)報(bào)道了離子液體可形成雙水相體系，且該體系在萃取分離領(lǐng)域表現(xiàn)出優(yōu)異的性能［5］。Jiang等［6］利用離子液體雙水相分離了青霉素；Ana等［7］用離子液體雙水相提取分離了香蘭素；豆甲立等［8］研究了陽(yáng)離子表面活性劑／離子液體／水三元體系20℃時(shí)的相圖，并用其成功提取分離了辣椒色素；邱祖民等［9］研究了PMBP縮2－ABT與中性磷類提取劑磷酸三丁酯（TBP）在離子液體雙水相體系中對(duì)稀土離子的萃取行為。對(duì)于該體系在蛋白質(zhì)提取分離方面的應(yīng)用與作用機(jī)制，在初步研究基礎(chǔ)上［10］，本試驗(yàn)探討了親水性離子液體［Bmim］Cl和K2HPO4形成上相富集離子液體和下相富集磷酸鹽的雙水相體系的成相規(guī)律，并對(duì)菜籽粕中蛋白質(zhì)進(jìn)行了提取研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

菜籽蛋白（由低溫菜籽粕用酶法提取制得［11］，經(jīng)Kjeldahl法測(cè)得蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)76.5%）：自制品；1－丁基－3－甲基咪唑氯鹽（［Bmim］Cl）、1－烯丙基－3－甲基咪唑氯鹽（［Amim］Cl）、1－乙基吡啶溴鹽（［Epy］Br）（純度均 ＞99%）：中科院蘭州物理化學(xué)研究所；Commassie Blue Staining G－250溶液、Britton－Robinson（B.R）緩沖溶液：均按常規(guī)方法配制；K2HPO4等化學(xué)試劑均為分析純：水：自制純水。

722型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；pHs－3C型精密酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；THZD臺(tái)式恒溫振蕩器：太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SL1202型電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 相圖的繪制［12］

溶解度測(cè)定：在30℃恒溫下，首先稱取一定量的K2HPO4（m1）于燒杯中，加蒸餾水溶解，然后加入一定量的離子液體（m2），直至混合溶液恰好出現(xiàn)渾濁，稱量（m總），即可得到各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再加蒸餾水至澄清，如此循環(huán)數(shù)次后得到溶解度曲線，用經(jīng)驗(yàn)方程關(guān)聯(lián)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)與離子液體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系，并繪制相圖。

相平衡數(shù)據(jù)測(cè)定：以三角形相圖為指導(dǎo)，選取大致合適當(dāng)系統(tǒng)點(diǎn)配制溶液。于15 mL刻度試管中，加入一定量的離子液體，再加入一定量K2HPO4水溶液，定容至刻度，振蕩搖勻60 min，放置2 h，待溶液分相完全，分別測(cè)得上、下相溶液的密度及K2HPO4的質(zhì)量（用磷鉬藍(lán)分光光度法［13］測(cè)得），得到上、下相中K2HPO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；利用溶解度曲線的經(jīng)驗(yàn)關(guān)聯(lián)方程由K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)算得離子液體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而得到上、下相中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即為雙水相液－液相平衡數(shù)據(jù)。

1.2.2 離子液體雙水相提取菜籽蛋白

在10 mL刻度比色管中加入3.000 g的離子液體，0.800 g的K2HPO4，一定量的菜籽蛋白溶液，在研究酸度影響時(shí)再加入不同pH值的B.R緩沖溶液1.00 mL，用二次水稀釋到8.00 mL。200 r／min恒溫震蕩20 min，放置30 min，分相清晰后，取上相溶液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，按下式計(jì)算菜籽蛋白的提取率（E）及分配比（D，為避免相比（上下兩相液體的體積比）的影響而選定分配比為兩相蛋白質(zhì)質(zhì)量比）。上相離子液體可通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空干燥過(guò)夜等簡(jiǎn)單處理后重復(fù)使用。

蛋白質(zhì)提取率＝（上相蛋白質(zhì)質(zhì)量／加入的總蛋白量）×100%

分配比＝上相蛋白質(zhì)總質(zhì)量／下相蛋白質(zhì)總質(zhì)量

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析方法

相圖采用Origin8.0軟件繪制并用經(jīng)驗(yàn)法進(jìn)行分析；其他數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件處理并用直觀分析法和方差分析法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ［Bmim］Cl／K2 HPO4雙水相系統(tǒng)相圖

2.1.1 溶解度曲線及相圖

按1.2.1方法測(cè)得30℃時(shí)［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O體系的數(shù)據(jù)用1.2.3方法繪得相圖如圖1所示。在此三角相圖中，溶解度曲線的兩個(gè)端點(diǎn)A和B表示［Bmim］Cl＋K2HPO4＋水的飽和溶液，A點(diǎn)為［Bmim］Cl飽和水溶液，B點(diǎn)K2HPO4飽和水溶液，而點(diǎn) M和點(diǎn) N則分別表示［Bmim］Cl和K2HPO4水的飽和溶解度。連接 PQ，PM，QN，AP，AQ將相圖分為五個(gè)區(qū)域：其中Ⅰ區(qū)域?yàn)镵2HPO4＋［Bmim］Cl＋H2O不飽和溶液的單相區(qū)；Ⅱ區(qū)域?yàn)殡p水相區(qū)上相為離子液體相，主要含有大量的［Bmim］Cl及少量的K2HPO4和水，而下相為水相，主要為大量的水和K2HPO4及少量的［Bmim］Cl；Ⅲ區(qū)域?yàn)椋跙mim］Cl＋K2HPO4＋兩個(gè)水飽和溶液（P和Q）與［Bmim］Cl固體（A）的三相區(qū)；Ⅳ區(qū)域?yàn)椋跙mim］Cl＋K2HPO4＋H2O的飽和溶液（Q）、K2HPO4的飽和水溶液（N）與［Bmim］Cl固體（A）的三相區(qū)；Ⅴ為［Bmim］Cl飽和水溶液（M）、［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O飽和溶液與［Bmim］Cl固體（A）的三相區(qū)。試驗(yàn)結(jié)果可知，［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O系形成雙水相，質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍：［Bmim］Cl為5.16%～63.74%，K2HPO4為4.48%～76.72%，H2O為18.12%～60.88%。

圖1 30℃［Bmim］Cl＋K2 HPO4＋H2 O三元體系相圖

2.1.2 溫度對(duì)相圖的影響

按1.2.1方法測(cè)得不同溫度下［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元體系相圖，如圖2所示。由圖2可知，隨溫度從30℃升高到60℃，溶解度曲線向內(nèi)收縮，上相的離子液體相所占比例逐漸下降，這表明高溫使雙水相區(qū)的離子液體相體積縮小，相比明顯降低，對(duì)雙水相的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的提取不利。為使離子液體雙水相對(duì)菜籽粕蛋白的穩(wěn)定且良好的提取效果，故本試驗(yàn)的離子液體雙水相體系提取分離菜籽蛋白時(shí)溫度選用30℃。

圖2 不同溫度［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元體系相圖的影響

2.1.3 溶解度曲線的關(guān)聯(lián)

按1.2.1的濁度法測(cè)得30℃時(shí)［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O體系中上、下相［Bmim］Cl、K2HPO4溶解情況，結(jié)果如圖3和圖4所示；又用Origin8.0軟件對(duì)其進(jìn)行非線性回歸，結(jié)果得到上、下相的K2HPO4與［Bmim］Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方程為式（1）、（2）。從相關(guān)系數(shù)看，在該體系的上、下相中K2HPO4與［Bmim］Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)有極高的關(guān)聯(lián)精度，也說(shuō)明兩方程式的表述是可靠的。

圖3 上相K2HPO4與［Bmim］Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

圖4 下相K2HPO4與［Bmim］Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的關(guān)系

2.2 離子液體雙水相提取菜籽蛋白

2.2.1 離子液體對(duì)體系成相及菜籽蛋白提取率的影響

分別用［Amim］Cl、［Bmim］Cl和［Epy］Br等離子液體與K2HPO4形成雙水相體系提取菜籽蛋白，其中［Bmim］Cl的提取率最高（≥98%），且用量少，成相明顯，故試驗(yàn)中選用［Bmim］Cl作為成相的離子液體。

在只改變［Bmim］Cl加入量下按試驗(yàn)方法試驗(yàn)，考察［Bmim］Cl加入量對(duì)菜籽蛋白提取率的影響。從圖5表明，當(dāng)離子液體質(zhì)量濃度＜250mg／mL時(shí)，溶液不成相；當(dāng)離子液體質(zhì)量濃度≥250mg／mL時(shí)，隨著離子液體濃度的增大，相比逐漸增大，菜籽蛋白的分配系數(shù)也增大，其提取率也同時(shí)增大。當(dāng)離子液體質(zhì)量濃度低于350mg／mL時(shí)，隨著離子液體質(zhì)量濃度的增大，提取率逐漸增大；當(dāng)在350～400 mg／mL之間時(shí)趨于一定，提取率也達(dá)到最大（＞98%）；當(dāng)大于400mg／mL時(shí)，離子液體濃度過(guò)高，體積排阻效應(yīng)增大導(dǎo)致菜籽蛋白在相間的傳遞和在相中的擴(kuò)散阻力大大增加，不利于蛋白質(zhì)進(jìn)入離子液體相，提取率明顯降低。綜合考慮，試驗(yàn)中離子液質(zhì)量濃度選為350mg／mL。

圖5 ［Bmim］Cl質(zhì)量濃度對(duì)提取率和分配比的影響

2.2.2 鹽對(duì)體系成相及菜籽蛋白提取率的影響

按1.2.2方法，進(jìn)行鹽的單因素考察試驗(yàn)，結(jié)果如圖6。從圖6可知，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量濃度＜100mg／L時(shí)，溶液不成相；當(dāng)K2HPO4質(zhì)量濃度≥100mg／L時(shí)，形成雙水相，且隨著鹽量的增加，相比逐漸減小。蛋白質(zhì)提取率在體系不形成雙水相前幾乎不變化，形成雙水相后迅速達(dá)到最高峰，然后隨鹽量的增加由于相比和分配比都呈逐漸減小趨勢(shì)，而使提取率呈現(xiàn)逐漸下降，且下降速率幾乎恒定。其原因是：鹽量太少體系不成相或提取不完全，當(dāng)K2HPO4質(zhì)量濃度達(dá)150mg／L時(shí)提取率最大（≥99%），鹽的質(zhì)量濃度超過(guò)150 mg／L后提取率又有所減??；這可能是鹽的濃度過(guò)大，對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的鹽效應(yīng)起主要作用，影響了離子液與菜籽蛋白作用的穩(wěn)定性，從而降低蛋白質(zhì)的提取率。

圖6 K2 HPO4濃度對(duì)提取率和分配比的影響

2.2.3 蛋白質(zhì)濃度對(duì)體系成相和提取率的影響

按1.2.2方法，進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度的單因素考察試驗(yàn)，結(jié)果如圖7。從圖7可知，當(dāng)菜籽蛋白質(zhì)量濃度低于75.0 mg／L時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率隨蛋白質(zhì)濃度增大而增大；當(dāng)菜籽蛋白質(zhì)量濃度在65.0～110 mg／L之間時(shí)，提取率變化趨于基本平穩(wěn)，但稍有下降；當(dāng)菜籽蛋白濃度大于110 mg／L，提取率呈明顯下降趨勢(shì)。

圖7 菜籽蛋白濃度對(duì)提取率和分配比的影響

2.2.4 pH值對(duì)體系成相和菜籽蛋白提取率的影響

按1.2.2方法，進(jìn)行不同pH值的B.R緩沖溶液的單因素考察試驗(yàn)，結(jié)果如圖8。從圖8可知，溶液pH值在4～7時(shí)菜籽蛋白提取效果好。pH值＞7或pH值＜4，菜籽蛋白提取率均呈下降趨勢(shì)，且酸性條件下的下降趨勢(shì)顯著大于堿性。其原因是：蛋白質(zhì)與離子液體之間的作用力主要為靜電作用和氫鍵作用［10］，菜籽蛋白等電點(diǎn)為3.5，在等電點(diǎn)及附近離子液體與蛋白質(zhì)間主要靠氫鍵作用，隨著pH值減小，蛋白質(zhì)帶正電荷越明顯，與離子液體陽(yáng)離子間排斥作用增強(qiáng)，從而使提取率降低；當(dāng)溶液pH值在大于等電點(diǎn)的一定范圍內(nèi)時(shí)，帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)增強(qiáng)了與離子液體中陽(yáng)離子間靜電引力，從而提取率較高。

圖8 溶液pH對(duì)提取率和分配比的影響

2.2.5 離子液體雙水相提取菜籽蛋白質(zhì)條件的優(yōu)化

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，在［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O雙水相體系中，選擇［Bmim］Cl濃度、K2HPO4濃度、菜籽蛋白質(zhì)濃度和pH值等4個(gè)因素，依據(jù)優(yōu)化理論［14－15］設(shè)計(jì) L16（45）正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化并確定其最佳工藝條件，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)與安排見表1、試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。

由表2可以看出，經(jīng)極差分析得到所考察的4個(gè)因素對(duì)菜籽粕蛋白質(zhì)提取影響順序?yàn)椋篕2HPO4濃度＞［Bmim］Cl濃度＞菜籽蛋白濃度＞提取pH值。可見在此提取體系中鹽（K2HPO4）濃度對(duì)其提取蛋白質(zhì)的影響最大，而提取體系的pH值影響最小。方差分析結(jié)果也表明該提取體系中的鹽（K2HPO4）濃度屬極顯著的影響因素，離子液體（［Bmim］Cl）和蛋白質(zhì)濃度屬于顯著的影響因素，pH值為不顯著的影響因素。正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的該離子液體雙水相提取菜籽蛋白的最優(yōu)條件為：K2HPO4質(zhì)量濃度為150 mg／mL、［Bmim］Cl質(zhì)量濃度為 350 mg／mL、菜籽蛋白濃度為70.0 mg／L、pH值為6.8。根據(jù)正交試驗(yàn)效應(yīng)指標(biāo)的估算方法［15］得在最佳條件下的蛋白質(zhì)優(yōu)提取率 Y優(yōu)＝Y(jié)平均＋w1，max＋w2，max＋w3，max＝85.6＋8.63＋7.10＋4.28＝105.6%，出現(xiàn)估算提取率＞100%的原因是試驗(yàn)過(guò)程存在一定的誤差和估算的方法有一定的局限性。進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，在此最佳條件下菜籽蛋白提取率為99.1%，這與按優(yōu)化理論［15］的估算值（105.6%）雖有6.5%的差值，但還是在試驗(yàn)允許的誤差范圍內(nèi)，因此認(rèn)為兩者的結(jié)果還是基本吻合，也反映所設(shè)計(jì)的優(yōu)化試驗(yàn)是科學(xué)的，試驗(yàn)結(jié)果是可靠的。

表1 L16（45）正交試驗(yàn)的安排

表2 L16（45）正交試驗(yàn)的結(jié)果及分析（n＝3）

3 結(jié)論

3.1 采用濁度法測(cè)定得到［Bmim］Cl和K2HPO4在純水中的溶解度曲線，用回歸法得到溶解度方程具有高度的關(guān)聯(lián)性（相關(guān)系數(shù)均＞0.99），通過(guò)繪制的30℃下［Bmim］Cl＋K2HPO4＋H2O三元體系的相圖表明：該體系相圖分為5個(gè)相區(qū)：1個(gè)不飽和溶液?jiǎn)蜗鄥^(qū)，1個(gè)雙水相區(qū)，3個(gè)三相區(qū)；這為利用雙水相體系提取分離蛋白質(zhì)提供了理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.2 試驗(yàn)得到30℃時(shí)［Bmim］Cl／K2HPO4體系形成雙水相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為：［Bmim］Cl為5.16%～63.74%，K2HPO4為 4.48%～76.72%，H2O為18.12%～60.88%。這些相行為的信息為進(jìn)一步開發(fā)［Bmim］Cl／K2HPO4雙水相體系對(duì)生物活性物質(zhì)的提取分離提供了指導(dǎo)。

3.3 通過(guò)L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化得到［Bmim］Cl／K2HPO4離子液體雙水相體系提取菜籽粕中蛋白的最佳提取條件為：K2HPO4質(zhì)量濃度為 150 mg／mL、［Bmim］Cl質(zhì)量濃度為350 mg／mL、菜籽蛋白質(zhì)量濃度為70.0 mg／L、pH值為6.8；且驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果菜籽蛋白提取率達(dá)99.1%，與按優(yōu)化理論的估算值基本吻合。表明優(yōu)化試驗(yàn)是成功可靠的，為今后進(jìn)一步研究該體系的放大試驗(yàn)或規(guī)?；a(chǎn)奠定了相應(yīng)的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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