易 陽(yáng) 張名位 魏振承 黃 菲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所1，廣州 510610）

（武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院2，武漢 430023）

稻谷和大豆是極其重要的糧油資源。2010年，我國(guó)稻谷產(chǎn)量接近2億噸，而以大豆為主的豆類產(chǎn)量也有近0.2億噸［1］。米糠和豆粕分別是稻谷和大豆加工的主要副產(chǎn)物，目前絕大部分作為動(dòng)物飼料原料被廉價(jià)消耗掉。為提高米糠和豆粕的經(jīng)濟(jì)附加值，其功能活性成分，特別是多糖的生物活性評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用受到廣泛關(guān)注。多糖能有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，且不會(huì)產(chǎn)生（顯著的）毒副作用。香菇多糖、云芝多糖和裂褶菌多糖等，作為理想的免疫佐劑在臨床應(yīng)用上表現(xiàn)突出［2］。而灌胃一定劑量的米糠多糖或大豆多糖均能明顯提升正常小鼠免疫系統(tǒng)功能，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞吞噬功能有顯著的增強(qiáng)作用［3－5］。但其能否直接刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及是否作用于相同的效應(yīng)細(xì)胞，尚鮮見(jiàn)報(bào)道。多糖主要通過(guò)細(xì)胞表面受體與淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而觸發(fā)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其構(gòu)效關(guān)系的本質(zhì)在于多糖結(jié)構(gòu)與受體親和力的強(qiáng)弱［6－7］。多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且多樣，不同結(jié)構(gòu)對(duì)免疫細(xì)胞受體的親和力不同導(dǎo)致其活性有所差異，而關(guān)于米糠多糖和大豆多糖的免疫調(diào)節(jié)活性強(qiáng)弱尚未可知。鑒于此，本研究采用熱水法從米糠和豆粕中提取分離粗多糖，分析比較其結(jié)構(gòu)特性及體外對(duì)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的免疫刺激作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

脫脂米糠、豆粕：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所糧油加工與功能食品實(shí)驗(yàn)室；RAW264.7細(xì)胞：中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由本實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)；體重（20±2）g的BALB／C雄性小鼠：南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在9～10周齡時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試劑及儀器

RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清：美國(guó)Gibco公司；甲基噻唑基四唑（MTT）、刀豆球蛋白A（ConA）和脂多糖（LPS）：美國(guó) Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

SBS－Z100數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器、L－2恒流泵：上海青浦瀘西儀器廠；Nexus 5DXC紅外分光光譜儀、MK3酶標(biāo)儀：美國(guó)賽默飛世爾公司；MCO－175水套式 CO2培養(yǎng)箱：日本三洋公司；Agilent 6890－5973氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；L－8900氨基酸自動(dòng)分析儀：日本日立公司。

1.3 米糠多糖和大豆多糖的制備

米糠多糖和大豆多糖的提取方法參考文獻(xiàn)［8］，略有修改。50 g原料加入500 mL蒸餾水，在80℃水浴下恒溫?cái)嚢杞? h。4 500 r／min離心10 min分離上清液（米糠上清液需采用酶法除去可溶性淀粉），過(guò)濾分離提取液。采用Sevag法去除蛋白后，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮提取液。將濃縮液轉(zhuǎn)入透析袋（分子截留量8 000）中，在大量4℃蒸餾水中透析72 h。4 500 r／min離心10 min分離透析清液，濃縮并冷凍干燥為多糖樣品。米糠多糖（RBP）和大豆多糖（SBP）的得率分別為1.24%和1.09%。

1.4 化學(xué)組成測(cè)定

多糖含量采用苯酚硫酸法［9］測(cè)定；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定；單糖組成參考文獻(xiàn)［10］采用GC－MS測(cè)定；氨基酸組成參考文獻(xiàn)［11］采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.5 相對(duì)分子質(zhì)量分布分析

相對(duì)分子質(zhì)量分布參考文獻(xiàn)［12］采用Sephadex G－100凝膠過(guò)濾法測(cè)定。

1.6 光譜特征掃描

多糖的紅外和紫外光譜特征參考文獻(xiàn)［10］測(cè)定。

1.7 脾淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

小鼠經(jīng)摘眼球放血處死后，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液。以含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107cells／mL，50 μL／孔加入96孔板中。多糖經(jīng)完全培養(yǎng)液溶解并過(guò)濾除菌后，以40μL／孔 加入細(xì)胞孔內(nèi)，隨后每孔加入10μL培養(yǎng)液、50μg／mL ConA或50μg／mL LPS（多糖終濃度分別為0、50、100、200或 400μg／mL）。各試驗(yàn)組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)100μL培養(yǎng)液孔用于調(diào)零。將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，每孔加入5 mg／mL的 MTT 20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100μL酸性異丙醇，放置過(guò)夜。于570 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光值（A）。淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù) SI＝（A刺激組－A空白組）／A空白組×100%。

1.8 巨噬細(xì)胞吞噬功能和NO生成測(cè)定

RAW264.7巨噬細(xì)胞經(jīng)DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105cells／mL，以100μL／孔 加入96孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育3 h后，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去未貼壁細(xì)胞。多糖由完全培養(yǎng)液溶解并過(guò)濾除菌后，以100μL／孔 加入96孔板，終濃度為0、50、100、200或 400μg／mL，各濃度均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。另設(shè)5μg／mL LPS刺激孔作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸除上清液，以 PBS洗滌2遍，每孔加入0.1%中性紅的PBS溶液100μL，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。再棄去上清液，并用PBS洗滌3遍，每孔加入細(xì)胞裂解液100μL，4℃下放置過(guò)夜。于570 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)各孔A值。吞噬指數(shù) PI＝（A刺激組－A空白組）／A空白組×100%。

5×105cells／mL的RAW264.7巨噬細(xì)胞以500 μL／孔加入24孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育3 h后，由PBS洗去未貼壁細(xì)胞。多糖以500μL／孔加入24孔板，終濃度為0、50、100、200或400μg／mL，各濃度均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。另設(shè)5μg／mL LPS刺激孔作為對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔分別取150μL細(xì)胞液于1.5 mL離心管中，加入300 g／L的 ZnSO4溶液 10μL，混勻沉淀蛋白。每孔平行取樣3次。4 500 r／min離心10 min后，取100μL上清液于96孔培養(yǎng)板中，加入等體積的Griess試劑，室溫下輕輕搖振10 min，并于酶標(biāo)儀上測(cè)定492 nm處A值。通過(guò)NaNO2建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞液中 NO濃度（c，μmol／mL）。NO生成指數(shù) NI＝（c刺激組－c空白組）／c空白組×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并以S－N－K檢驗(yàn)比較各組間差異，顯著性水平為P＜0.05，以不同小寫(xiě)字母標(biāo)示。數(shù)據(jù)以ˉ±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RBP和SBP的化學(xué)組成

由表1可見(jiàn)，RBP和SBP的多糖及蛋白含量存在極為明顯的差異，其多糖與蛋白的質(zhì)量比值分別為7.71和1.90。多糖部分，RBP主要由葡萄糖和甘露糖以物質(zhì)的量比4.27∶1.00組成，而SBP主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖以物質(zhì)的量比5.55∶3.49∶1.00組成。蛋白質(zhì)部分，RBP中檢測(cè)出17種氨基酸，而SBP中含有15種且未檢測(cè)出天冬氨酸和絲氨酸，兩者的氨基酸組成中均以谷氨酸含量最高（表1）。

表1 多糖RBP和SBP的化學(xué)組成

2.2 RBP和SBP的相對(duì)分子質(zhì)量分布

多糖分子通過(guò)凝膠柱時(shí)，各級(jí)分根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量大小實(shí)現(xiàn)分離。由圖1可見(jiàn)，RBP的相對(duì)分子質(zhì)量分布較SBP分散。RBP在洗脫體積10～35 mL內(nèi)出現(xiàn)4個(gè)疊加的多糖峰，且以相對(duì)分子質(zhì)量較低級(jí)分（峰值31 mL）的含量最高。同時(shí)，該級(jí)分的多糖峰與蛋白峰響應(yīng)一致，推斷為蛋白多糖。SBP僅呈現(xiàn)唯一的多糖峰，且同在峰值30 mL處出現(xiàn)蛋白峰，說(shuō)明含有少量結(jié)合蛋白。由此可見(jiàn)，RBP和SBP的主要組成級(jí)分為蛋白多糖。

圖1 多糖RBP和SBP的Sephadex G－100凝膠過(guò)濾色譜圖

2.3 RBP和SBP的光譜特征

由紫外光譜圖可見(jiàn)（圖2），RBP和SBP分別在262和258 nm處出現(xiàn)明顯的蛋白吸收峰。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)RBP和SBP都具有多糖和蛋白的特征吸收（圖3），包括：3 398.2和 3 402.6 cm－1處羥基 O—H的伸縮振動(dòng)吸收峰；2 930.8和2 933.4 cm－1處氨基C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 654.9和1 654.1 cm－1處羰基C═O的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 541.5和1 558.5 cm－1處氨基N—H的彎曲振動(dòng)吸收峰；1 419.9和1 405.9 cm－1處羧基C—O的伸縮振動(dòng)吸收峰；以及1 024.3和1 050.9 cm－1處羥基O—H的彎曲振動(dòng)吸收峰。930.1和925.8cm－1處的反對(duì)稱環(huán)振動(dòng)吸收峰說(shuō)明RBP和SBP均含有D吡喃葡萄糖，而849.9和831.5 cm－1處吸收峰說(shuō)明其均含有α型糖苷鍵。

圖2 多糖RBP和SBP的紫外光譜圖

圖3 多糖RBP和SBP的紅外光譜圖

2.4 RBP和SBP對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

由圖4可見(jiàn)，RBP和SBP在50μg／mL劑量下促進(jìn)正常淋巴細(xì)胞增殖，但隨劑量增加表現(xiàn)出明顯的抑制作用。相比 ConA對(duì)照組，二者在50～400 μg／mL劑量范圍內(nèi)均顯著刺激ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖（P＜0.05），且以400μg／mL劑量的 SI值較高。相同劑量下，RBP和SBP對(duì)正?；駽onA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的SI值無(wú)顯著差異（P＞0.05）。相比LPS對(duì)照組，50μg／mL的RBP和SBP均能顯著刺激LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖（P＜0.05），且兩者無(wú)顯著差異（P＞0.05），而其高劑量都未表現(xiàn)出刺激作用。相反，200和400μg／mL的 SBP顯著抑制 LPS誘導(dǎo)的增殖作用（P＜0.05）。

圖4 多糖RBP和SBP對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.5 RBP和SBP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能及NO生成的影響

由圖5可見(jiàn)，RBP和 SBP在50～400μg／mL劑量范圍內(nèi)均能不同程度增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，且PI值與5μg／mL劑量LPS的作用相當(dāng)或更高。RBP和SBP在200μg／mL劑量下的PI值均顯著高于其他劑量（P＜0.05）。在100～400μg／mL范圍的相同劑量下，RBP的PI值明顯高于SBP（P＜0.05）。

圖5 多糖RBP和SBP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

圖6 多糖RBP和SBP對(duì)巨噬細(xì)胞NO生產(chǎn)的影響

由圖6可見(jiàn)，RBP在50～400μg／mL的劑量范圍明顯抑制巨噬細(xì)胞NO生成，而SBP卻能不同程度刺激巨噬細(xì)胞NO生成。但SBP作用下的NI值隨劑量的增加顯著降低（P＜0.05），其中僅50μg／mL劑量的刺激效果顯著強(qiáng)于5μg／mL劑量 LPS（P＜0.05）。

3 討論

分析60%乙醇沉淀的米糠粗多糖的組成發(fā)現(xiàn)，其中相對(duì)分子質(zhì)量較小級(jí)分的蛋白質(zhì)含量最高，而相對(duì)分子質(zhì)量較高級(jí)分的含量（48.1%）最高，且其主要亞級(jí)分由阿拉伯糖、半乳糖、木糖和葡萄糖組成［13］。通過(guò)熱提－極性pH值法提取得到的大豆粗多糖主要由含有9.2%結(jié)合蛋白的級(jí)分SSPS－1和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%的糖蛋白SSPS－2組成（與圖1中凝膠色譜分析較一致），而SSPS－1主要由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成［14］。本研究分離得到的RBP和SBP的蛋白質(zhì)含量、單糖組成以及相對(duì)分子質(zhì)量分布均與已有文獻(xiàn)存在較大差異，可能源于原料品種、提取方法以及純化程度的不同。β－消去反應(yīng)過(guò)程中，絲氨酸和蘇氨酸與單糖形成的O型糖苷鍵在弱堿條件下生成α－氨基丙烯酸和α－氨基丁酸，并導(dǎo)致240 nm處吸收增加［15］，由此證實(shí)RBP和SBP中均存在O型糖苷鍵（圖2）。結(jié)合化學(xué)組成和光譜分析，可以推斷RBP和SBP為主要由α－D－葡萄糖組成的蛋白多糖。

ConA和LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖體系常分別用于評(píng)價(jià)多糖對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞的刺激活性［16－17］。RBP和SBP都只在低劑量（50μg／mL）下刺激正常和LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，且隨劑量增加表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但兩者在50～400μg／mL范圍內(nèi)隨劑量增加顯著促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的增殖（圖4），說(shuō)明RBP和SBP可能選擇性刺激T細(xì)胞。研究枸杞多糖發(fā)現(xiàn)，蛋白含量相對(duì)高的LBP、LBPF4和LBPF5選擇性刺激T細(xì)胞活化，但蛋白含量相對(duì)少的LBPF1、LBPF2和LBPF3卻未表現(xiàn)出刺激作用，且LBP、LBPF4和LBPF5經(jīng)蛋白酶酶解后對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的刺激作用顯著降低［18］。相反，刺五加多糖選擇性刺激B細(xì)胞，而經(jīng)蛋白酶消化結(jié)合蛋白后，多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用并未減弱［19］。由此推測(cè)，RBP、SBP及枸杞多糖的結(jié)合蛋白可能對(duì)T細(xì)胞激活有重要作用。此外，RBP和SBP還能顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，但RBP明顯抑制其NO生成，而SBP卻隨劑量減小逐漸增加其NO生成（圖4和圖5）。分析其原因可能是：RBP刺激巨噬細(xì)胞的M2極化，促進(jìn)Th2應(yīng)答，NO生成減少；而SBP刺激巨噬細(xì)胞M1極化，促進(jìn)Th1應(yīng)答，增加包括NO在內(nèi)的炎癥介質(zhì)表達(dá)［16］。RBP和SBP均在體外表現(xiàn)出良好的脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活功能，其作用甚至強(qiáng)于5 μg／mL的ConA或LPS，作為免疫佐劑具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

從米糠和豆粕中分離得到的粗多糖RBP和SBP均為組成復(fù)雜的蛋白多糖，其結(jié)構(gòu)特征明顯不同，差異主要涉及結(jié)合蛋白含量、單糖和氨基酸組成以及相對(duì)分子質(zhì)量分布。在50～400μg／mL劑量范圍內(nèi)，RBP與SBP對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的刺激作用相當(dāng)，且效應(yīng)細(xì)胞一致。RBP對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的增強(qiáng)作用要略強(qiáng)于SBP，而兩者對(duì)其NO生成則發(fā)揮相反的作用。RBP和SBP在免疫調(diào)節(jié)活性上的異同與其結(jié)構(gòu)特征密切關(guān)聯(lián)，還需結(jié)合多糖的一級(jí)和高級(jí)結(jié)構(gòu)特征以及多糖的作用受體類型進(jìn)一步深入闡釋。

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