孫長坡 鄧婷婷 伍松陵 路子顯

（國家糧食局科學(xué)研究院1，北京 100037）

（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所2，北京 100025）

轉(zhuǎn)基因水稻研究始于1988年，日本東北大學(xué)的Toriyama等［1］和英國諾丁漢大學(xué)的 Zhang等［2］分別以水稻原生質(zhì)體為材料，利用電擊法獲得了水稻再生植株。同時，美國康乃爾大學(xué)的Zhang等［3］以水稻原生質(zhì)體為材料，利用PEG介導(dǎo)法獲得了水稻再生植株。1991年，Christou等［4］利用基因槍法轉(zhuǎn)化水稻取得成功，隨后，這種轉(zhuǎn)化方法成為水稻遺傳轉(zhuǎn)化的常規(guī)方法之一。1993年，我國臺灣Chan等［5］采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得轉(zhuǎn)基因水稻。1994年，日本的Hiei等［6］利用水稻成熟種子誘導(dǎo)的愈傷為受體，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻高效轉(zhuǎn)化體系。Hiei等［7－8］在2006年和2008年先后改進了這個高效轉(zhuǎn)化體系，使農(nóng)桿菌介導(dǎo)法變成水稻遺傳轉(zhuǎn)化的最常用方法。

Tu等［9］在 2000年將轉(zhuǎn)cry1Ab／Ac融合基因水稻進行田間試驗，在不噴灑殺蟲劑條件下，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟具有高度殺傷作用。曾千春等［10］把cry1Ac基因?qū)攵i稻明恢81獲得抗蟲純合系。Ghareyazie B等［11］將cry1Ab／2A轉(zhuǎn)化水稻，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟高度殺傷力。

轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因拷貝數(shù)的研究方法很多，其中Southern Blot方法［12］是最常用的轉(zhuǎn)基因植株的外源基因拷貝數(shù)分析方法，其他方法還有CGH，F(xiàn)ISH［13］和 Micro array［14］等。但是，這些方法存在不足之處如下：需要DNA量多、量大、費時、使用放射性同位素、發(fā)生重排的外源基因測定不準確等。隨著轉(zhuǎn)基因的谷物的種植和流通，轉(zhuǎn)基因成分的檢測和監(jiān)測技術(shù)研究也不斷發(fā)展和創(chuàng)新。一種快速、敏捷和高效的實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)受到越來越廣泛的應(yīng)用。2009年，我國農(nóng)業(yè)部為轉(zhuǎn)基因水稻Bt63頒發(fā)了生物安全證書，其抗蟲能力與外源基因的拷貝數(shù)密切相關(guān)。本研究之目的是利用實時熒光定量PCR技術(shù)，分析不同的轉(zhuǎn)基因稻米Bt63的外源基因相對含量，為建立轉(zhuǎn)抗蟲基因水稻抗蟲能力評價體系和轉(zhuǎn)基因稻谷進入糧食流通渠道提供檢測和監(jiān)測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗材料

待測樣品（轉(zhuǎn)基因Bt63稻米粉末）U1和U2各1 g／瓶，校準品（質(zhì)粒DNA含有目的基因）1瓶，內(nèi)源標準基因上下游引物（RBE－4－F和RBE－4－R）與內(nèi)源標準基因探針（RBE－4－MGB－P）各1支，外源基因上下游引物（Bt63－F和Bt63－R）與外源基因探針（Bt63－P）各1支，以上材料均由中國計量科學(xué)研究院提供。

1.1.2 試驗試劑

植物基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。TaqMan?2×PCR Mater Mix：羅氏公司。

1.1.3 試驗儀器

實時定量PCR分析系統(tǒng)（7900HT快速實時PCR系統(tǒng)）；DNA濃度測定儀器為Nanodrop 1000分光光度計（熱科學(xué)基因有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA提取

根據(jù)試劑盒操作手冊提取和純化待測樣品（轉(zhuǎn)基因Bt63稻米粉末）U1和U2的DNA。利用DNA濃度測定儀器測定DNA含量。

1.2.2 Taqman探針法反應(yīng)條件

外源基因PCR反應(yīng)體系25μL，其中2×Taqman Universal MasterMix緩沖液12.5μL，10μmol／L上下游引物各1μL，10μmol／L外源基因探針 0.5μL，DNA模板（＜30 ng／μL）5μL。內(nèi)源基因PCR反應(yīng)體系也是25μL，其中2×Taqman Universal MasterMix緩沖液12.5μL，10μmol／L上下游引物各0.5μL，10μmol／L內(nèi)源基因探針 0.25μL，DNA模板（＜30 ng／μL）5μL。反應(yīng)條件：50℃，2 min；95℃，10 min；40個循環(huán)（95℃，15 s；60℃，60 s）。ABI Prism?7900型熒光定量PCR儀在60℃復(fù)性和延伸時收集熒光信號。

1.2.3 標準曲線的建立及數(shù)據(jù)分析

外源基因的標準曲線的制作是將帶有目的基因的質(zhì)粒 DNA按10、100、1 000、10 000和100 000倍稀釋，并以這些稀釋的DNA為模板進行PCR反應(yīng)，得到各自的Ct值，通過Ct值與起始模板數(shù)的對數(shù)值之間存在的線性關(guān)系，獲得標準曲線。水稻內(nèi)源的標準曲線的制作是以基因組 DNA做100、1 000、10 000、100 000和1 000 000倍稀釋，用與外源基因標準曲線相同的方法獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的制作

2.1.1 內(nèi)源標準曲線

RBE－4基因的標準曲線如圖1所示：RBE－4基因的標準曲線的相關(guān)系數(shù)R＝0.996 6，說明已經(jīng)滿足了熒光定量的標準曲線的精度要求。該基因Ct值與起始模板之間的相關(guān)性方程為：y＝2.734 3x＋41.268，方程式中y代表Ct值，x代表log COPY。

圖1 RBE－4基因real－time PCR標準曲線

2.1.2 外源標準曲線

Bt63基因的標準曲線如圖2所示：Bt63基因的標準曲線的相關(guān)系數(shù)R＝0.995 4，說明相關(guān)性很高。該基因Ct值與起始模板之間的相關(guān)性方程為：y＝－2.326 0x＋39.319，方程式中y代表Ct值，x代表log COPY。

圖2 Bt63基因（B）real－time PCR標準曲線

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的內(nèi)外源基因的Ct值

在本試驗中，對兩個不同的轉(zhuǎn)基因樣品U1和U2分別進行3次熒光定量PCR反應(yīng)，每次設(shè)3個重復(fù)。獲得樣品的Ct值如表1。

表1 RBE－4基因和Bt63基因在U1和U2中的Ct值

表2 RBE－4基因和Bt63基因在U1中拷貝數(shù)和比值

表3 RBE－4基因和Bt63基因在U2中拷貝數(shù)和比值

從表1可知，在內(nèi)外源基因之間，外源基因（Bt63）Ct值高于內(nèi)源基因（RBE－4）Ct值。在 U1和U2樣品之間，雖然二者的內(nèi)源基因（RBE－4）Ct值差異不顯著，但是，U1的外源基因（Bt63）Ct值高于U2的外源基因（Bt63）Ct值。

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻Bt63的內(nèi)外源基因的拷貝數(shù)

根據(jù)內(nèi)外源基因的標準曲線方程，計算出它們各自對應(yīng)的基因拷貝數(shù)，進一步計算出外源基因在兩個轉(zhuǎn)基因水稻中的相對含量見表2和表3。

從表2中數(shù)據(jù)算出：U1的外源基因平均含量為0.28%，SD為0.001 4，RSD為0.498 1。

從表3中數(shù)據(jù)算出：U1的外源基因平均含量為0.018%，SD為0.009 8，RSD為0.544 4。

3 討論

隨著國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因水稻的商品化步伐提速和我國對轉(zhuǎn)基因糧油及其制品的進口規(guī)模的加大，相應(yīng)的外源基因含量檢測技術(shù)的研究也不斷深入。最近幾年，我國利用實時熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因拷貝數(shù)或含量研究上正方興未艾。楊立桃等［15］比較了實時熒光定量PCR和Southern blot兩種技術(shù)在水稻轉(zhuǎn)GUS和HPT基因拷貝數(shù)研究中的差異，發(fā)現(xiàn)實時熒光定量 PCR的分析結(jié)果與Southern blot分析結(jié)果基本一致，僅個別樣品稍高。然而，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性最好的定量方法。因此，實時熒光定量PCR方法已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。王育花等［16］通過SYBR實時熒光定量PCR法檢測了轉(zhuǎn)基因水稻中NAS1的拷貝數(shù)。林波等［17］利用實時熒光定量PCR技術(shù)測定了不同轉(zhuǎn)基因水稻中Bar和CaMV35S相對含量。敖金霞等建立了檢測轉(zhuǎn)基因水稻深加工產(chǎn)品的外源基因的TaqMan和SYBR Green I方法的定量檢測技術(shù)，兩者的檢測靈敏度均達到0.01%［18］。

針對轉(zhuǎn)基因水稻Bt63檢測技術(shù)的研究目前鮮見報道。我們的研究結(jié)果表明：兩個轉(zhuǎn)基因Bt63稻米樣品U1和U2的外源基因含量存在一定的差異。由于本次試驗樣品較少，僅重復(fù)3次，不僅U1和U2的內(nèi)源基因Ct值沒有很好落在內(nèi)標曲線上，而且U2的外源基因Ct值也沒有很好落在外標曲線上。這些問題將在以后的試驗中加以改進和提高。

通過熒光定量PCR技術(shù)能夠完成轉(zhuǎn)基因成分的定量分析。2009年11月27日 ，農(nóng)業(yè)部批準發(fā)放轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻“華恢1號”和“Bt汕優(yōu)63”安全證書。雖然尚未允許商業(yè)化生產(chǎn)，但提前研究和開發(fā)相應(yīng)的檢測技術(shù)將為轉(zhuǎn)基因稻谷進入流通行業(yè)儲備技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本試驗較早地利用熒光定量PCR技術(shù)研究了兩個轉(zhuǎn)基因Bt63稻米樣品U1和U2的外源基因含量，發(fā)現(xiàn)它們的外源基因含量存在顯著差異。這項研究的繼續(xù)深入將為建立轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲能力評價體系和轉(zhuǎn)基因稻谷進入糧食流通渠道提供檢測和監(jiān)測技術(shù)基礎(chǔ)。

志謝：感謝中國檢驗檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所陳穎研究員和黃文勝研究員給予的幫助。感謝中國計量科學(xué)研究院董蓮華博士、隋志偉和李亮提供轉(zhuǎn)基因水稻樣品（稻米粉末）和有關(guān)生物試劑。

［1］Toriyama K，Arimotoa Y，Uchimiyaa H，et al.Transgenic riceplants after direct gene transfer into protoplasts［J］.Nature Biotechnology，1988，6：1072－1074

［2］Zhang HM，Yang H，Rech EL.Transgenic rice plants produced by electroporation－mediated plasmid uptake into protoplasts［J］.Plant Cell Report，1988，7：379－384

［3］Zhang W，Wu R.Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correctly regulated expression of foreign gene in the plants［J］.Theory Application Genetics，1988，76：835－840

［4］Christou P，F(xiàn)ord T，Kofron M.Production of transgenic rice（Oryza SativaL.）plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos［J］.Nature Biotechnology，1991，9：957－962

［5］Chan MT，Chang HH，Ho SL.Agribacterium mediated production of transgenic rice plants expressing chimericα－amylase promoter／β－glucuronidase gene［J］.Plant Molecular Biology，1993，22：491－506

［6］Hiei Y，Ohta S，Komari T，et al.Efficient transformation of rice（Oryza SativaL.） mediated by Agribacterium and squence analysis of the boundaries of T－DNA［J］.Plant Journal，1994，6：271－282

［7］Hiei Y，Komari T.Improved protocols for transformation of indica rice mediated by Agribacterium tramefaciens［J］.Plant Cell Tissue Organ Culture，2006，85：271－283

［8］Hiei Y，Komari T.Agribacterium－mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed［J］.Nature Protocol，2008，3：824－834

［9］Tu J，Zhang G，Datta K，et al.Field performance of transgenic elite commercial hybrid rice expressing bacillus thuringiensis delta－endotoxin［J］.Nature Biotechnology，2000，18（10）：1101－1104

［10］曾千春，吳茜，周開達，等.修飾的cry1Ac基因?qū)攵i稻明恢81獲得抗蟲純合系［J］.遺傳學(xué)報，2002，29：519－524

［11］Ghareyazie B，Alinia F，Menguito C A，et al.Enhanced resist－ance to two stem borers in an aromatic rice containing a synthetic cry1A（b）gene［J］.Molecular Breed，2009，3：401－414

［12］Gendloff EH，Bowen B，Buchholz WG.Quantitation of chloramphenicol acetyl transferase in transgenic tobacco plants by ELISA and correlation with gene copy number［J］.Plant Molecular Biolology，1990，14（4）：575－83

［13］Thompson CT，Gray JW.Cytogenetic profiling using fluorescence in situ hybridization（FISH）and comparative genomic hybridization（CGH）［J］.Journal of Cell Biochemstry Supplement，1993，17G：139－43

［14］Bilke S，Chen QR，Whiteford CC，et al.Detection of low level genomic alterations by comparative genomic hybridization based on cDNA micro－arrays［J］.Bioinformatics，2005，21（7）：1138－45

［15］楊立桃，趙志輝，丁嘉羽，等.利用實時熒光定量PCR方法分析轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2005，17（2）：140－144

［16］王育花，趙森，陳芬，等.利用實時熒光定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)的研究［J］.生命科學(xué)研究，2007，11（4）：301－305

［17］林波，譚支良，肖國櫻，等.稻谷中轉(zhuǎn)Bar基因水稻含量的實時熒光定量檢測［J］.農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，2008，29（5）：618－621

［18］敖金霞，高學(xué)軍，權(quán)東升，等.轉(zhuǎn)基因水稻深加工產(chǎn)品兩種熒光定量方法的比較研究［J］東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，42（1）：34－39

［19］EC Regulation 1998／11391 Council Regulation（EC）No 1139／98 of 26 May 1998 Concerning the Compulsory Indication of the Labeling of Certain Foodstuffs Produced from Genetically Modified Organisms of Particulars other than Those Provided for in D79／112／EEC1 Brussels，Belgium 1L159：4－7.