何玉杰 花日茂 李世廣 李茂業(yè) 黃衍章 沈宗海

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院1，合肥 230036)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院2，合肥 230036)

(合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院3，合肥 230036)

(安徽中谷國家糧食儲備庫4，合肥 230031)

長角扁谷盜Cryptolestes pusillus(Sch?nherr)屬鞘翅目扁甲科，全世界廣泛分布，中國普遍分布，是一種后期性倉儲害蟲，為害破碎和損傷的糧食、豆類、油籽類、副產(chǎn)品及各種粉類、干果、香料等，是糧食倉庫、加工廠、藥材庫、醬品廠的常見害蟲[1]，經(jīng)常發(fā)生在玉米象、谷蠹等初期性倉蟲危害之后，條件適宜時，易大量發(fā)生引起儲糧發(fā)熱、結(jié)塊、霉變。

由于長期單一使用化學(xué)殺蟲劑防治儲糧害蟲，包括長角扁谷盜在內(nèi)的許多害蟲產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[2]，在提高使用劑量與增強(qiáng)抗性之間形成惡性循環(huán)。更嚴(yán)重的是，糧食中化學(xué)農(nóng)藥殘留量的嚴(yán)重超標(biāo)及對環(huán)境的污染，直接影響出口和施藥者及消費者的健康，人們對農(nóng)產(chǎn)品安全問題的擔(dān)心和憂慮與日俱增，所以研究和探索使用高效低毒或無毒的物質(zhì)來防治儲糧害蟲是實現(xiàn)綠色儲糧，保證食品安全與人類健康的要求。植物源殺蟲劑具有諸多優(yōu)點，如選擇性強(qiáng)，對非靶標(biāo)生物相對安全；易降解，殘留低，一般不污染環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品；因其是天然的混配復(fù)劑，害蟲不易產(chǎn)生抗性；屬于“環(huán)境和諧農(nóng)藥”，符合農(nóng)產(chǎn)品安全和人類發(fā)展現(xiàn)代農(nóng)藥所追求的目標(biāo)[3]。因此，植物源殺蟲劑的研究和應(yīng)用得到了國內(nèi)外專家的極大重視[4－8]，成為現(xiàn)代農(nóng)藥發(fā)展的主流和熱點之一。

八角茴香(Illicium verumHook.F.)別名八角、大茴香、大料，為木蘭科八角茴香的干燥成熟果實，是衛(wèi)生部2002年3月5日公布的“既是食品又是藥品”的物品之一。八角茴香屬常綠喬木，原產(chǎn)于中國西南地區(qū)和越南等亞熱帶地區(qū)。中國廣西、云南、廣東、福建、貴州等省(區(qū))均有栽培，中國八角種植面積和產(chǎn)量均占世界的80%以上[9]。

目前，對八角茴香的研究主要集中在食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[9－10]。八角整?？捎糜谂腼冋{(diào)味，粉狀可用于肉類制品等，為“五香粉”的主要原料，有去腥、殺菌、防腐的作用。八角茴香精油是用八角的果實、種子、葉提煉出的芳香油，可作香精，是食品、甜酒、飲料、卷煙、香水、香皂、牙膏、化妝品等日化產(chǎn)品的增香劑。八角茴香性辛溫，味甘，具有溫陽散寒、理氣止痛的功效，中醫(yī)臨床用來治療胃寒嘔吐、疝氣腹痛、腎虛腰痛、除干濕腳氣、治神經(jīng)衰弱等，從八角提取的莽草酸可生產(chǎn)用于治療人禽流感的抗感冒藥——達(dá)菲。國內(nèi)外也有研究表明，八角茴香精油對玉米象(Sitophilos zeamaisMotsehulsky)、德國小蠊(Blattella germanica)等害蟲具有驅(qū)避、熏蒸等生物活性[11－12]。

為了進(jìn)一步確定八角茴香在儲糧害蟲防治中應(yīng)用的可能性，用3種有機(jī)溶劑對八角茴香干果進(jìn)行提取，驗證提取物對倉儲主要的后期害蟲長角扁谷盜成蟲的觸殺和驅(qū)避作用，為今后將八角茴香開發(fā)成為新型綠色儲糧保護(hù)劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DD－120B電動植物粉碎機(jī):浙江溫嶺市大海藥材器械廠；GRX－9071B烘箱:上海?，斣O(shè)備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱:廣東醫(yī)療器械廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52CS－1):上海亞榮生化儀器廠；FA2104電子天平:上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。甲醇(沸點64.5℃)、乙酸乙酯(沸點77.2℃)、石油醚(沸程60～90℃)、丙酮(沸點56.0℃):上海振企化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試蟲的采集與飼養(yǎng)

長角扁谷盜成蟲采自安徽中谷國家糧食儲備庫，在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)。將放入烘箱(100℃)中消毒2 h后的小麥，調(diào)整含水量至(13±1)%，再粉碎為全麥粉，然后以1/4全麥粉質(zhì)量的整粒小麥與全麥粉混合分裝于罐頭瓶中。接入試蟲后，置于養(yǎng)蟲室，在溫度(28±1)℃，相對濕度(75±5)%，全黑暗的條件下飼養(yǎng)。7 d后排除成蟲，待新一代成蟲大量羽化后7～10 d，篩出成蟲供試驗用。

1.3 供試植物

八角茴香干果:市售，產(chǎn)地為廣西。

1.4 八角茴香提取物的制備

將八角茴香果實在60℃烘箱中烘干，用電動粉碎機(jī)將其粉碎成粉末，過40目篩。分別稱取適量粉末干樣，加入5倍的溶劑置于室溫(25℃)下，避光浸提48 h，過濾出溶劑。再按上述步驟浸提2次，集合3次濾液，得到粗提物。將所有的粗提物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮至再無溶劑滴出，稱重，并計算提取率。提取物裝在棕色瓶內(nèi)，置于4℃冰箱中備用。

1.5 生物活性測定方法

1.5.1 觸殺作用的測定

采用濾紙藥膜法并稍加改進(jìn)[4]。將直徑9 cm的濾紙放入相同直徑的培養(yǎng)皿內(nèi)，在濾紙上放置內(nèi)徑8 cm，高5 cm內(nèi)壁涂有聚四氟乙烯的玻璃環(huán)防止試蟲上爬。用丙酮將各溶劑提取物均稀釋成不同濃度的藥液，用移液槍取各稀釋液1 mL，滴入濾紙上藥液被完全吸收，待丙酮完全揮發(fā)后，按每皿30頭接入試蟲，皿內(nèi)不加飼料，蓋上鐵絲網(wǎng)，防止試蟲逃逸。濾紙滴入純丙酮1 mL作空白對照，每處理重復(fù)3次。將各處理放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(T:27～29℃，RH:70%～80%)，分別于處理24、48、72 h調(diào)查試蟲死亡數(shù)。處理72 h后，將試蟲轉(zhuǎn)入盛有40 g半碎小麥的廣口瓶內(nèi)，用白布塊封住管口，置于養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)7 d后，檢查觸殺效果。以毛筆觸及試蟲無任何反應(yīng)者為死亡標(biāo)準(zhǔn)。計算死亡率，并用 Abbott公式校正。

1.5.2 驅(qū)避作用的測定

采用濾紙藥膜法并加以改進(jìn)[4]。將直徑為9 cm的濾紙剪成相同兩半，一半用移液管分別移取不同濃度的藥液0.5 mL均勻注于濾紙上，室溫下使丙酮揮發(fā)；另一半滴入同體積的丙酮，揮發(fā)干后作為對照。將兩半濾紙重新接上，用黏膠紙固定后置于同直徑培養(yǎng)皿內(nèi)。皿底涂抹固體膠，防止試蟲鉆入濾紙下面。將內(nèi)徑8 cm，高5 cm內(nèi)壁涂有聚四氟乙烯的玻璃環(huán)放入培養(yǎng)皿中，防止試蟲上爬。每皿接入30頭試蟲，皿內(nèi)不加飼料，加上鐵絲網(wǎng)蓋防止試蟲逃逸。重復(fù)3次。將各處理放入養(yǎng)蟲室中，分別于24、48、72 h時后檢查處理邊和對照邊的蟲數(shù)，計算驅(qū)避率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

提取率＝濃縮后提取物重/植物干粉重×100%

校正死亡率＝(處理組死亡率－對照組死亡率)/(1－對照組死亡率)×100%

驅(qū)避率＝(對照邊蟲數(shù)－處理邊蟲數(shù))/對照邊蟲數(shù)×100%

分級標(biāo)準(zhǔn):0級，即無驅(qū)避作用；Ⅰ級＝0.01%～20%驅(qū)避率；Ⅱ級＝20.01%～40%驅(qū)避率；Ⅲ級＝40.01%～60%驅(qū)避率；Ⅳ級＝60.01%～80%驅(qū)避率；Ⅴ級 ＝80.01%～100%驅(qū)避率[13]。

用DPS軟件計算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和致死中量(LD50)，并采用Duncan新復(fù)極差法檢驗比較各處理的死亡率和驅(qū)避率的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑對八角茴香干果的提取效果

由表1可以看出，3種有機(jī)溶劑對八角茴香干果的提取率以甲醇最高，乙酸乙酯和石油醚次之。在同樣條件下不同溶劑對八角茴香干果的提取效率不同，其原因是溶質(zhì)在溶劑中溶解符合“相似相容”規(guī)律，待浸取成分與溶劑的分子極性越相似，其溶解度越大。甲醇、乙酸乙酯、石油醚的極性依次為:6.6、4.4、0.0，因此，推測八角茴香干果中極性物質(zhì)的含量較高。

表1 3種有機(jī)溶劑對八角茴香干果的提取率

2.2 八角茴香提取物對長角扁谷盜成蟲的生物活性

2.2.1 觸殺活性

分別設(shè)計了5個處理劑量，采用濾紙藥膜法來測定八角茴香3種溶劑提取物對長角扁谷盜成蟲的觸殺效果，結(jié)果見表2。從表2中看出，3種提取物對長角扁谷盜成蟲均具有很強(qiáng)的觸殺作用，且3種提取物的觸殺效果均隨著處理劑量的增加而顯著增強(qiáng)；同種溶劑提取物在相同處理劑量下，其觸殺效果隨時間的延長而逐漸增強(qiáng)。用最大劑量148.63μg/cm2處理72 h后，甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物對試蟲的校正死亡率分別為87.85%、90.98%和94.44%。

表2 八角茴香干果的3種溶劑提取物對長角扁谷盜成蟲的觸殺作用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

將表2中八角茴香干果的甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物的處理劑量與長角扁谷盜成蟲處理72 h的平均死亡率之間的關(guān)系，進(jìn)行毒力回歸直線分析，得到這3種提取物對長角扁谷盜成蟲的觸殺毒力回歸方程和LD50(見表3)。由表3可知，八角茴香干果的甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物處理長角扁谷盜成蟲72 h后的LD50分別為28.21、23.51和19.23μg/cm2，觸殺效果最好的是石油醚提取物，其次是乙酸乙酯提取物，最后是甲醇提取物。

表3 八角茴香干果的3種溶劑提取物對長角扁谷盜成蟲處理72 h后的觸殺毒力回歸分析

2.2.2 驅(qū)避活性

由表4可知:八角茴香的同種溶劑提取物的劑量越高，其對長角扁谷盜成蟲驅(qū)避作用越大；甲醇、乙酸乙酯和石油醚3種溶劑提取物的最高劑量(123.46μg/cm2)的平均驅(qū)避率分別為:62.23%、73.22%和40.16%，其驅(qū)避等級分別為Ⅳ級、Ⅳ級和Ⅲ級；八角茴香3種有機(jī)溶劑提取物對長角扁谷盜成蟲驅(qū)避作用大小依次為:乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物＞石油醚提取物。同種溶劑提取物在相同劑量下，隨著處理時間的延長，其驅(qū)避作用整體呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于藥液的揮發(fā)導(dǎo)致濃度下降，使得驅(qū)避作用下降；另外，試驗中發(fā)現(xiàn)，八角茴香的3種溶劑提取物對試蟲均有一定的麻痹作用，這可能與驅(qū)避率的下降也有一定的關(guān)系。

表4 八角茴香干果的3種溶劑提取物對長角扁谷盜成蟲的驅(qū)避作用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

3 討論與結(jié)論

3.1 甲醇、乙酸乙酯和石油醚3種有機(jī)溶劑對八角茴香干果的提取率分別為:23.67%、14.21%和14.00%。根據(jù)相似相容的原理，待浸取成分與溶劑的分子極性越相似，其溶解度越大。物質(zhì)的極性與其分子結(jié)構(gòu)和分子大小有關(guān)，根據(jù)生物活性追蹤結(jié)果，對于已知活性較高的成分，可根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)判斷其極性，再選擇合適的溶劑進(jìn)行浸取分離，從而提高提取效率[14]。

3.2 從八角茴香的3種溶劑提取物的觸殺活性可以看出:3種提取物對長角扁谷盜成蟲均具有很強(qiáng)的觸殺作用，觸殺效果隨處理劑量的增加而顯著增強(qiáng)，隨時間的延長而逐漸增強(qiáng)。用148.63μg/cm2劑量處理72 h后，甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物對試蟲的致死率分別為87.85%、90.98%和94.44%。從致死中量上看，甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物對長角扁谷盜成蟲處理72 h后的LD50分別為28.21、23.51和19.23μg/cm2，因此，八角茴香3種溶劑提取物對長角扁谷盜成蟲的觸殺效果依次為:石油醚提取物＞乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物。

3.3 從3種提取物的驅(qū)避活性可以看出:同種溶劑提取物的劑量越高，對長角扁谷盜成蟲的驅(qū)避作用越大；甲醇、乙酸乙酯和石油醚3種溶劑提取物的最高劑量(123.46μg/cm2)的平均驅(qū)避率分別為:62.23%、73.22%和40.16%，其驅(qū)避等級分別為Ⅳ級、Ⅳ級和Ⅲ級；對長角扁谷盜成蟲驅(qū)避作用大小依次為:乙酸乙酯提取物＞甲醇提取物＞石油醚提取物。徐漢虹等[15]報道八角茴香精油在200～800μL/cm2劑量下，對赤擬谷盜成蟲的驅(qū)避作用也能達(dá)到Ⅳ級以上，但比本試驗的處理劑量明顯要高。

3.4 對八角茴香的化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)，干果含精油約8%～12%，精油的主要成分為反式茴香腦——茴香醚(C10H12O)，含量達(dá) 80%以上，尚含茴香醛(C8H8O2)、茴香酮(C10H12O2)、黃樟醚(C10H10O2)等[9]。所以，今后在研制新型殺蟲劑的過程中，若對其提取物或精油中高活性化合物進(jìn)行分離和鑒定，采用生物活性追蹤的方法研究其活性成分及構(gòu)效關(guān)系，選擇其活性成分較高且結(jié)構(gòu)式相對簡單的化合物，進(jìn)行仿生合成和結(jié)構(gòu)改造或直接利用其粗提品，進(jìn)行制劑加工，可望加工成對原糧和成品糧均有效的谷物保護(hù)劑，既可達(dá)到經(jīng)濟(jì)、高效防治害蟲的目的，又可減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，控制害蟲抗藥性的發(fā)展，而且對于推動八角及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也具有重要的生產(chǎn)實踐意義。

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