宋永康 黃 薇 姚清華 林香信 林 虬

(福建省農(nóng)業(yè)科學院中心實驗室福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點實驗室，福州 350003)

水產(chǎn)動物不同于畜禽等單胃動物和反芻動物，其對營養(yǎng)物質(zhì)的需求、攝取、消化與吸收等方面都有其特性。以鰻鱺為例，其飼料不僅要求具有良好的誘食性、營養(yǎng)性，還需要具有良好黏彈性即蛋白原料與α－淀粉的親和性[1]。近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛，水產(chǎn)飼料蛋白源匱乏日趨嚴重，尋找和開發(fā)新的飼料蛋白源已成當務之急。隨著寡肽吸收理論的提出及其生理功能特性認識的加深，運用酶解技術(shù)提高植物蛋白品質(zhì)使其替代魚粉等動物源性蛋白已成為當前研究的熱點[2－3]。大量研究表明，豆粕經(jīng)酶解制備的大豆多肽具有眾多有利于動物生長的功能和特性，應用在飼料中不僅能夠降低成本，并且可以提高動物的生產(chǎn)性能以及免疫力[4－6]。Rerat等[7]的研究顯示，小肽吸收是逆濃度梯度轉(zhuǎn)運過程，與游離氨基酸相比，具有耗能低、不易飽和、吸收速度快等特點。

目前，國內(nèi)外對豆粕酶解研究主要集中在抗營養(yǎng)因子的去除或鈍化、蛋白質(zhì)的改性以及酶解產(chǎn)物的生物學功能性上，追求高水解度，對酶解產(chǎn)物的加工性能關(guān)注較少[8－12]。肽蛋白的營養(yǎng)特性和加工性能與其水解方式和水解程度有密切的相關(guān)性，因此必須對水解過程進行嚴格控制[13]。以水解度(DH)為指標，易引起過度水解，導致部分寡肽被徹底水解成游離氨基酸，影響水解產(chǎn)物的加工性能；以酸溶蛋白(或TCA－N)為指標，其結(jié)果是反映分子質(zhì)量小于10 ku的可溶性肽[14]，易造成水解不足，導致飼料的消化率降低；水解不足或過度均不能達到理想效果。本研究首次提出以寡肽得率(分子質(zhì)量≤2 ku)為指標，同時與水解度進行比較，優(yōu)化 Alcalase和 Flavourzyme雙酶同步水解制備寡肽豆粕的工藝，并對兩種指標制備的產(chǎn)品進行加工質(zhì)量指標分析評價，旨在探討豆粕水解進程對水產(chǎn)飼料加工性能的影響，為促進豆粕在水產(chǎn)特種養(yǎng)殖業(yè)上的有效利用以及提高豆粕產(chǎn)品質(zhì)量提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆粕(粗蛋白含量46.12%):福州科匯生物技術(shù)有限公司；Alcalase(活力 380 000 U/mL)、Flavourzyme(活力 430 000 U/mL):丹麥 Novozymes公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT):合肥新恩源生物技術(shù)公司；對苯二甲醛(OPA)、單寧酸、甲醛、氫氧化鈉、鹽酸等試劑:國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要設(shè)備

Kjeltec 2300自動定氮儀:瑞典Foss有限公司；HJ－3恒溫磁力攪拌器、3HA－C恒溫振蕩器:常州國華電器有限公司；TD5A－WS離心機:長沙湘儀離心機儀器有限公司；AL204電子分析天平:梅特勒－托利多(上海)有限公司；PHS－3C pH酸度計:上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水解度的測定

水解度(DH，Degree of Hydrolysis)的定義是指蛋白質(zhì)水解過程中，被斷裂的肽鍵數(shù)h(mmol/g蛋白質(zhì))與給定蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)htot(mmol/g蛋白質(zhì))之比。水解度的測定方法采用鄰苯二甲醛(OPA)法[15]，其計算公式為:DH＝h/htot×100%。

1.3.2 寡肽得率的測定

寡肽含量采用單寧酸沉淀法并參考 DB35/T 1089—2011進行測定，通過凱氏定氮法測定經(jīng)16%單寧酸沉淀后濾液中的寡肽與游離氨基酸總含量，再用甲醛滴定法測定濾液中游離氨基酸的含量，計算兩者的差值即為寡肽的含量。其計算公式為:寡肽得率＝(單寧酸溶蛋白含量－游離氨基酸含量)/總蛋白×100%。

1.3.3 黏彈性評價

黏彈性參照SC/T 1047—2001中規(guī)定的方法測定，稱取經(jīng)粉碎(通過80目)寡肽豆粕38 g與12 g的α－淀粉混均，加入55 mL蒸餾水，在(25±2)℃下，拌和均勻，拉伸20次。

1.3.4 溶失率的測定

參照SC/T 1047—2001中規(guī)定的方法測定溶失率。按照1.3.3方法處理兩組樣品，取一組放置靜水中，在水溫(25±2)℃下浸泡1 h，撈出后與另一組對照樣品同時放入烘箱中，105℃恒溫烘至恒重，冷卻后分別準確稱重。其計算公式為:溶失率＝(對照料烘干質(zhì)量－浸泡料烘干質(zhì)量)/對照料烘干質(zhì)量×100%。

1.3.5 工藝路線

稱取粉碎豆粕置于反應杯中，按一定比例加水勻漿，放置90℃水浴鍋中浸提15 min，用氫氧化鈉或者鹽酸調(diào)節(jié)體系pH至酶的最適pH，加入一定量的蛋白酶，在適當溫度下恒溫酶解，反應結(jié)束后，取出樣品溶液置于沸水浴中滅酶15 min，5 000 r/min離心10 min，所得上清液測定寡肽得率、DH后進行烘干、粉碎，所得樣品即為寡肽豆粕，取適量用于黏彈性評價和溶失率測定。

1.3.6 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定酶活力比(Alcalase:Flavourzyme)為 2∶1，考慮底物濃度、加酶量、反應pH、反應溫度以及酶解時間等因素對豆粕寡肽得率的影響，選擇5因素4水平進行L16(45)正交試驗，優(yōu)化各因素組合。正交試驗因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

正交試驗結(jié)果采用SAS9.0進行極差和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解時間對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度10%、酶濃度2 000 U/g、Alcalase與Flavourzyme酶活力比1∶1、pH 8.0、溫度50℃的條件下，測定不同的酶解時間對豆粕寡肽得率和DH的影響(圖1)。在0～8 h的酶解過程中，體系DH和寡肽得率均不斷增加；當水解時間達到8 h時，寡肽得率達到最大；8 h后DH繼續(xù)升高而寡肽得率降低。這可能是Flavourzyme包含有內(nèi)切肽酶和外切肽酶兩種活性，不僅作用于肽鏈內(nèi)部的肽鍵，而且作用于肽鏈外部的肽鍵，較長的酶解時間導致了部分寡肽被徹底水解成游離氨基酸。因此，確定適宜的酶解時間為8 h。

圖1 酶解時間對寡肽得率和DH的影響

2.1.2 底物濃度對寡肽得率和DH的影響

在酶濃度2 000 U/g、Alcalase與 Flavourzyme酶活力比1∶1、pH 8.0、溫度50℃的條件下酶解8 h，測定不同底物濃度酶解后的豆粕寡肽得率和DH(圖2)。隨著底物濃度的增加，水解度和寡肽得率逐漸降低；當?shù)孜餄舛却笥?0%時，水解液離心分離后溶液渾濁不清。這是由于底物濃度過高，體系流動性較差，不利于蛋白質(zhì)的充分溶解和分散，酶與底物的接觸機會也逐漸降低。底物濃度不僅影響DH和寡肽得率，而且直接決定生產(chǎn)成本，生產(chǎn)中應盡量提高底物濃度。綜合考慮生產(chǎn)成本和酶解效率，確定底物適宜濃度為10%。

圖2 底物濃度對寡肽得率和DH的影響

2.1.3 pH對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度10%、酶濃度2 000 U/g、Alcalase與Flavourzyme酶活力比1∶1、溫度50℃、酶解時間8 h的條件下，測定不同pH值對豆粕寡肽得率和DH的影響(圖3)。pH值在6.0～10.0的范圍內(nèi)，寡肽得率和DH的變化呈相似趨勢，均為先增大之后再減小，在pH 8.0時達到最高。酶的催化能力與pH密切相關(guān)，環(huán)境pH值能夠影響酶分子的構(gòu)象和酶與底物的解離狀態(tài)，從而影響酶的催化反應速率和酶與底物的結(jié)合，過高或過低均對酶促反應不利。因此選定8.0作為水解的最適pH。

圖3 pH對寡肽得率和DH的影響

2.1.4 溫度對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度10%、酶濃度2 000 U/g、Alcalase與Flavourzyme酶活力比 1∶1、pH 8.0、酶解時間 8 h的條件下，測定不同溫度對豆粕寡肽得率和DH的影響(圖4)。當反應溫度較低(45～55)℃時，體系寡肽得率和DH隨溫度升高而逐漸上升，并于55℃時達到最大值；相反地，當反應溫度較高(55～65)℃時，則體系寡肽得率和DH隨溫度升高而逐漸下降。在溫度較低時，溫度升高能加劇蛋白質(zhì)分子的擴散使得酶促反應加快，但過高的溫度易引起維持酶分子結(jié)構(gòu)次級鍵解體，導致酶失活速率加快。故確定最適反應溫度為55℃。

圖4 反應溫度對寡肽得率和DH的影響

2.1.5 酶活力比對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度 10%、酶濃度2 000 U/g、pH 8.0、溫度55℃、酶解時間8 h的條件下，測定Alcalase與Flavourzyme酶活力比對豆粕寡肽得率和DH的影響(圖5)。結(jié)果表明，酶活力比對豆粕寡肽得率影響不明顯。當 Alcalase與 Flavourzyme酶活力比為2∶1時，體系寡肽得率和DH最大。因此，后續(xù)的雙酶同步水解試驗，選取Alcalase酶與Flavourzyme酶活力比為 2∶1。

圖5 酶活力比對寡肽得率和DH的影響

2.1.6 加酶量對寡肽得率和DH的影響

在底物濃度10%、Alcalase與Flavourzyme酶活力比為2∶1、pH 8.0、溫度55℃、酶解時間8 h的條件下，測定不同加酶量對豆粕寡肽得率和DH的影響，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，加酶量在400～3 200 U/g范圍內(nèi)，寡肽得率與DH隨加酶量的增加而快速上升，當加酶量達到3 200 U/g時，再進一步增加酶用量，寡肽得率與DH增幅不明顯，此時酶分子與底物分子接觸飽和，轉(zhuǎn)化效率達到最大，因而寡肽得率基本不再變化。綜合考慮酶解反應過程，選用加酶量3200 U/g較為適宜。

圖6 加酶量對寡肽得率和DH的影響

2.2 正交試驗

L16(45)正交組合試驗結(jié)果與分析見表2和表3。由表2極差R可知，影響豆粕寡肽得率大小順序為:A＞B＞D＞C＞E，而影響豆粕DH的各因素主次順序為:C＞D＞A＞B＞E，這說明各因數(shù)對豆粕寡肽得率和DH的影響次序有差異。方差分析結(jié)果表明(表3):寡肽得率模型的P值小于0.01，復相關(guān)系數(shù)R2＝0.978，校正決定系數(shù)AdjR2＝0.958，表明寡肽得率模型為滿意模型，除酶解時間影響顯著外，其他因素對寡肽得率的影響均極顯著(P＜0.01)；DH模型的P值小于0.01，同樣表明該模型為滿意模型，各因素對DH的影響極顯著(P＜0.01)。

在所選因素水平下，寡肽得率的最佳組合為A1B2C3D4E2，即底物濃度 8%、加酶量 3000U/g、pH 8.0、溫度61℃、酶解時間7.5h。在該組合條件下，豆粕寡肽得率為38.16%，DH為22.69%。而在DH的最優(yōu)組合A1B3C4D3E2，即底物濃度8%、加酶量3200U/g、反應 pH8.5、反應溫度 58℃、酶解時間7.5h。在該組合條件下，DH升至26.93%，寡肽得率降為32.21%，因此選用不同的參數(shù)指標對水解的產(chǎn)物關(guān)系密切。

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析表

2.3 寡肽豆粕的加工質(zhì)量指標

在寡肽得率最佳組合A1B2C3D4E2和DH最優(yōu)組合A1B3C4D3E2條件下水解豆粕，產(chǎn)物經(jīng)烘干、粉碎，制成兩種寡肽豆粕產(chǎn)品，對其黏彈性進行評價并測定溶失率。DH最優(yōu)組合的產(chǎn)品黏彈性和伸展性欠佳，展開成薄狀有裂痕，按凹后不能完全反彈復原且會黏手，溶失率高達(6.8±0.9)%，超過 SC/T 1077—2004漁用配合飼料粉料溶失率≤5%的要求。寡肽得率最佳組合的產(chǎn)品具有良好的黏彈性和伸展性，經(jīng)拉伸后體積明顯膨脹，能承受壓力，展開成薄狀均勻有序，按凹后很快反彈復原且不黏手，溶失率僅為(2.5±0.7)%，表明該產(chǎn)品與α－淀粉具有較佳的親和性，能夠滿足特種水產(chǎn)飼料加工質(zhì)量指標要求。

3 結(jié)論

3.1 選用Alcalase和Flavourzyme對豆粕進行同步酶解，體系寡肽得率與加酶量、反應pH及反應溫度顯著相關(guān)，體系DH與加酶量、反應pH、反應溫度及酶解時間顯著相關(guān)，寡肽得率模型和DH模型均為滿意模型。

3.2 確定Alcalase與Flavourzyme同步酶解制備寡肽豆粕的最佳工藝條件為:酶活比(Alcalase:Flavourzyme)2∶1、加酶量 3 000 U/g、底物濃度 8%、反應pH 8.0、反應溫度61℃、酶解時間7.5 h。在此條件下水解豆粕，DH為22.69%，寡肽得率可達38.16%。

3.3 建立了以寡肽得率為控制參數(shù)的雙酶同步法制備寡肽豆粕的工藝條件，解決了蛋白酶解過程中水解不足或過度問題。制備的寡肽豆粕粉與α－淀粉具有較好的親和性，散失率僅為(2.5±0.7)%，質(zhì)量指標能達到特種水產(chǎn)飼料加工要求。

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