曹延萍，王 莎，劉 杰，李 航，潘風(fēng)軍，李亞林，段惠軍△

（1.河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，石家莊050017；2.邯鄲市第一醫(yī)院腎內(nèi)科，3.邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北邯鄲056002）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是臨床常見和多發(fā)的糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）微血管并發(fā)癥。足細(xì)胞是高度特異、終末分化的上皮細(xì)胞，其丟失是蛋白尿形成的啟動(dòng)機(jī)制之一。凋亡是其丟失的重要因素，在DN的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。線粒體損傷途徑是經(jīng)典凋亡途徑之一，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M糖尿病的體外環(huán)境，探討線粒體功能障礙在糖尿病腎病足細(xì)胞凋亡中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 材料

H-2Kb-tsA58轉(zhuǎn)基因小鼠條件永生型小鼠足細(xì)胞（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心）。兔抗caspase-3多克隆抗體、小鼠抗cytochrome C多克隆抗體、兔抗β-actin多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），TUNEL試劑盒（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 足細(xì)胞的分組 復(fù)蘇細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成2組：正常糖對(duì)照組（normal glucose group，NG）：D-葡萄糖 1 g／L；高糖培養(yǎng)組（high glucose group，HG）：D-葡萄糖 4.5 g／L，經(jīng)細(xì)胞同步化、分組干預(yù)刺激48、72 h后收集細(xì)胞及上清液。

1.2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞并固定，蛋白酶K消化，TDT酶反應(yīng)液 37℃孵育 1 h，Streptavidin-HRP室溫 5 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染（陰性對(duì)照用無酶標(biāo)記液代替TDT酶反應(yīng)液）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 （1）收集細(xì)胞，固定。（2）離心（1 000 r／min，5min），洗滌，加入 DNA染液（PI 50μg／ml，RNA酶 10μg／ml及1%的 Triton-X100）1ml，4℃染色30min，上機(jī)檢測(cè)。（3）應(yīng)用Expo32ADC軟件分析，二倍體細(xì)胞峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰判定為凋亡細(xì)胞峰，根據(jù)亞二倍體峰的分布組方圖計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位（ΔΨm） 收集細(xì)胞，制成1～2×106cells／ml細(xì)胞懸液，加入 Rh123探針（終濃度為 10μg／ml），避光孵育 10min，離心（1 000 r／min，4min），洗滌，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為470～490 nm，發(fā)射波長為515～565 nm。

1.2.5 Western blot檢測(cè) cyt-c、caspase-3蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，洗滌，加入裂解液 300μl，冰浴 1 h，4℃、12 000 r／min離心20min，吸取上清?？捡R司亮藍(lán)法測(cè)定上清蛋白濃度，分裝后-80℃保存。每個(gè)樣品取50μg蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電壓100 V，進(jìn)入10%分離膠改為120 V，約2.5 h停止，60 V電轉(zhuǎn)移1 h，取出PVDF膜，脫脂奶粉37℃封閉2 h，加入一抗兔抗 caspase-3，小鼠抗 cyt-c多克隆抗體（1∶500），兔抗β-actin多克隆抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。洗滌后辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG（1：5 000稀釋），37℃孵育1.5 h。洗滌，將ECL試劑盒中A液和B液等量混合，滴于膜上，暗室中壓片，顯影，定影，掃描儀透掃后，用美國UVP公司LabWorks 4.5軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行定量分析，讀取積分光密度值（IOD），以管家基因β-actin作為內(nèi)參照校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞凋亡

與正常對(duì)照組相比，高糖刺激組細(xì)胞凋亡率在48 h時(shí)明顯高于正常對(duì)照組，并呈時(shí)間依賴性（圖1、圖2，表1）

2.2 足細(xì)胞線粒體跨膜電位的改變

高糖組自48 h起較正常對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)ΔΨm明顯下降（圖 3）。

Fig.1 Apoptotic cells in podocyte at 72 h after situmulation（TUNEL×200）

Fig.2 Apoptosis rate change of podocyte at72 h after situmulation（flow cytometry）

Tab.1 Apoptosis rate of podocyte after NG and HG situmulation detected by flow cytometry（%，±s，n＝6）

Tab.1 Apoptosis rate of podocyte after NG and HG situmulation detected by flow cytometry（%，±s，n＝6）

NG：Normal glucose group；HG：High glucose group*P＜0.05 vs NG

G r o u p A p o p t o s i s r a t e 2 4 h 4 8 h 7 2 h N G 1.6 5±0.4 0 4.2 9±1.8 7 5.6 3±0.4 9 H G 2.5 8±0.7 1 9.1 8±0.2 6*1 5.5 1±1.0 8*

Fig.3 ΔΨm change of podocyte at72 h detected by flow cytometry

2.3 Western blot結(jié)果

Western blot半定量分析結(jié)果顯示，高糖刺激組各時(shí)間點(diǎn)cyt-c、caspase-3表達(dá)較正常糖對(duì)照組增強(qiáng)（圖4）。

Fig.4 Expression of cytochrome C and caspase-3 protein in podocyte detected byWestern blot

3 討論

糖尿病腎損害是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，隨著對(duì)腎小球?yàn)V過屏障結(jié)構(gòu)、功能改變研究的深入，其主要組成部分足細(xì)胞在DN發(fā)生發(fā)展中的作用，逐漸成為研究熱點(diǎn)。過多丟失足細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致腎小球基底膜（glomerular basementmembrane，GBM）外露，與腎小球壁層上皮細(xì)胞黏連，形成腎小球硬化［1］，并與 DN蛋白尿及腎功能損害密切相關(guān)［2］。足細(xì)胞是終末分化上皮細(xì)胞，缺乏再生能力，其損傷在腎小球疾病的起始與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

凋亡是足細(xì)胞數(shù)量減少的重要原因之一，線粒體損傷途徑是經(jīng)典凋亡途徑［3］。研究認(rèn)為線粒體功能障礙起源的死亡信號(hào)在凋亡發(fā)生過程中起核心作用［4］。正常情況下，線粒體內(nèi)膜上生物呼吸鏈的發(fā)生，使內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子不均勻分布產(chǎn)生質(zhì)子梯度，形成線粒體膜內(nèi)負(fù)外正的電位差，即線粒體膜電位（mitochondrial transmembrane pitentials，ΔΨm），是維護(hù)其內(nèi)外物質(zhì)平衡，保持功能正?；顒?dòng)所必需的。ΔΨm的下降或者消失，使呼吸鏈斷裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡［4］。細(xì)胞色素 C（cytochrome C，cyt-c）是線粒體內(nèi)第一個(gè)被鑒定出的細(xì)胞凋亡因子，cyt-c從線粒體釋放后，不僅使線粒體呼吸鏈、電子傳遞受阻，細(xì)胞能量供應(yīng)減少，還可水解caspase-9酶原成caspase-9，進(jìn)一步水解 caspase-3酶原［5］。caspase-3是 caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，活化的caspase-3激活核因子、細(xì)胞骨架蛋白及DNA裂解酶等，引起細(xì)胞形態(tài)的變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，研究認(rèn)為caspase-3在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用［7］。

腦缺血／再灌注損傷中，線粒體跨膜電位崩解，呼吸鏈解耦聯(lián)，線粒體基質(zhì)滲透壓升高，線粒體腫脹，外膜破裂，cyt-c進(jìn)入胞質(zhì)與Apaf-1和procaspase-9結(jié)合連同ATP構(gòu)成凋亡體，激活procaspase-9后隨之活化下游的caspase-3，最終導(dǎo)致依賴cyt-c和caspase途徑的細(xì)胞凋亡［7］。在糖尿病大鼠腎損害過程中，DM組大鼠腎組織抗氧化防御能力受損，腎臟ΔΨm明顯降低，提示高糖可導(dǎo)致線粒體損傷。我們的研究結(jié)果顯示，高糖刺激的足細(xì)胞凋亡率于48 h較正常對(duì)照組明顯升高，并隨時(shí)間延長呈增多趨勢(shì)。同時(shí)我們用羅丹明Rh123標(biāo)記兩組細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化，結(jié)果顯示高糖刺激組較正常糖對(duì)照組足細(xì)胞線粒體膜電位下降，且各時(shí)間點(diǎn)cyt-c、caspase-3表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)，提示高糖刺激足細(xì)胞后可能通過引起線粒體功能障礙，cyt-c的釋放，促發(fā)caspase細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，caspase-3凋亡途徑被激活并參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡機(jī)制。盡管這種作用機(jī)制尚未完全清楚，推測(cè)可能與下列因素有關(guān)：線粒體是結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜而敏感的重要細(xì)胞器之一，很多因素如氧化應(yīng)激過度、能量耗竭等均會(huì)引起線粒體功能受損，凋亡基因激活等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些環(huán)節(jié)互為因果，相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終可導(dǎo)致細(xì)胞受損或凋亡，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，高糖可引起氧化反應(yīng)簇（reactive oxygen specie，ROS）產(chǎn)生增多，線粒體既是 ROS產(chǎn)生的主要部位，也是ROS攻擊的首要靶點(diǎn)，高血糖時(shí)，ROS增多可能是線粒體損傷的主要原因，而線粒體功能障礙引起細(xì)胞凋亡又可能在糖尿病腎臟損害的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。因此，保護(hù)腎臟線粒體功能，防護(hù)線粒體氧化損傷，可成為防治DN的新策略，并為臨床新型藥物的研發(fā)提供重要思路。

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