高洪波，張連元

（1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭014040；2.河北聯(lián)合大學(xué)，唐山063000）

肢體缺血／再灌注（limbs ischemia／reperfusion，LI／R）不僅可以引起局部缺血組織的損傷，還可以導(dǎo)致遠(yuǎn)隔部位器官損傷，肺臟是容易受累器官之一，主要表現(xiàn)為急性肺損傷（acute lung injury，ALI）。缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning，IPC）是一種內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，Harkin等［1］認(rèn)為此主要與肢體缺血預(yù)處理抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)，其確切機(jī)制尚無定論。P選擇素（p-selectin，P-s）在中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的起始階段介導(dǎo)中性粒細(xì)胞沿內(nèi)皮滾動、粘附。本研究旨在觀察IPC對大鼠LI／R后肺組織P-s表達(dá)的影響，進(jìn)而探討IPC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型復(fù)制

健康雄性Wistar大鼠（200～250）g由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供，共24只。動物隨機(jī)分為三組（n＝8）：對照（C）組、肢體缺血／再灌注（LI／R）組和缺血預(yù)適應(yīng)（IPC）組。復(fù)制肢體缺血／再灌注損傷模型：乙醚淺麻醉下以橡皮帶環(huán)繞結(jié)扎大鼠雙后肢近端，阻斷血流4 h后松解，松解前將大鼠稱重后用20%烏拉坦（5ml／kg）腹腔麻醉。IPC組預(yù)先阻斷雙后肢血流5 min，然后恢復(fù)血流灌注5 min，反復(fù)4次，其余操作同LI／R組。C組橡皮帶松弛環(huán)繞后肢不阻斷血流。將各組大鼠于恢復(fù)雙后肢血流灌注4 h經(jīng)腹主動脈用注射器取血致死，同時剖胸取肺備測各項指標(biāo)。

1.2 檢測指標(biāo)

1.2.1 肺呼吸功能的檢測 取動脈血后立即用自動血?dú)夥治鰞x測定動脈血氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2）。

1.2.2 肺水腫指標(biāo)的測定 肺系數(shù)（lung index，LI）測定：將肺于氣管分叉上1 cm剪斷，稱量肺濕重，計算肺系數(shù)（肺重／體重）（g／kg）。肺濕干比（wet／dry，W／D）測定：取肺組織約300mg，用濾紙吸凈表面血跡后稱濕重，置于80℃烤箱烘干72 h后取出稱干重，計算其比值。

1.2.3 MDA和MPO活性測定 采用試劑盒（南京建成生物制品公司）測定各組動物血漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及肺組織中 MDA含量和髓過氧化物酶（myeloperoxide，MPO）活性。

1.2.4 P-s的蛋白測定 采用免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）的方法檢測各組動物肺組織P-s的蛋白表達(dá)情況，結(jié)合計算機(jī)自動圖像分析系統(tǒng)對其結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 SPSS 11.5軟件處理實驗數(shù)據(jù)，組間比較用One-Way ANOVA分析后，采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組動物血?dú)獾淖兓?/h3>

與 C組比較，LI／R組 PaO2降低 33.4% （P＜0.01，表1）。IPC組PaO2雖然也低于C組，但與 LI／R組比較升高23.0%（P＜0.01，表 1）。各組動物 PaCO2差異無顯著性（P＞0.05，表 1）。

Tab.1 Results of blood／gas analysis of different groups（mmHg，±s，n＝8）

Tab.1 Results of blood／gas analysis of different groups（mmHg，±s，n＝8）

C：Control；LI／R：Limbs ischemia／reperfusion；IPC：Ischemic preconditioning**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs LI／R group

Group PaO2 PaCO 2 C 30.10±4.26 95.67±7.94 33.08±6.08 LI／R 63.67±3.61** 34.23±5.21 IPC 78.33±5.62**＃＃

2.2 各組動物L(fēng)I、W／D和血漿MDA的變化

與C組比較，LI／R組大鼠LI、W／D和MDA均明顯升高，分別升高 16.7%、23.9%和 69.7%（P＜0.01，表 2）。與 LI／R組相比，IPC組大鼠LI、W／D和MDA均明顯降低，分別降低7.8%、10.3%和 23.4%（P＜0.01，表 2）。

2.3 各組動物肺組織MDA、MPO、P-s的變化

與C組比較，LI／R組大鼠肺組織MDA、MPO和P-s均有不同程度的升高，分別升高 63.4%、27.3%和 187.5%（P＜0.01，表3），P-s陽性信號主要表達(dá)于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖1）。IPC組與LI／R組比較各項指標(biāo)均有不同程度的降低，分別降低 24.0%、7.3%和 34.8%（P＜0.01，表 3）。

Tab.2 Changes of LI、W／D and the values of plasma MDA of differentgroups（±s，n＝8）

Tab.2 Changes of LI、W／D and the values of plasma MDA of differentgroups（±s，n＝8）

C：Control；LI／R：Limbs ischemia／reperfusion；IPC：Ischemic preconditioning；LI：Lung index；W／D：Wet／dry；MDA：Malondialdehyde**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs LI／R group

Group LI（g／kg） W／D MDA（nmol／ml ）C 4.79±0.33 4.14±0.23 2.94±0.20 LI／R 5.59±0.14**5.13±0.27**4.99±0.37**IPC 5.15±0.17**＃＃4.60±0.11**＃＃3.82±0.40**＃＃

Tab.3 Values of MDA、MPO and P-s in lung tissue of different groups（±s，n＝8）

Tab.3 Values of MDA、MPO and P-s in lung tissue of different groups（±s，n＝8）

C：Control；LI／R：Limbs ischemia／reperfusion；IPC：Ischemic preconditioning；MDA：Malondialdehyde；MPO：Myeloperoxide；P-s：P-selectin**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs LI／R group

Group MDA（nmol／mg pro）MPO（U／g）P-s（AOD）C 1.12±0.13 1.83±0.11 0.056±0.005 LI／R 1.83±0.39**2.33±0.16**0.161±0.007**IPC 1.39±0.10＃＃ 2.16±0.14**0.105±0.007**＃＃

Fig.1 Immunohistochemical staining with anti-p-selectin of lung tissue（IHC×100）

3 討論

肢體缺血／再灌注損傷是臨床上較常見的病理過程。研究表明，肢體缺血／再灌注后不僅加重局部組織的損傷，而且易引起其它遠(yuǎn)隔器官的繼發(fā)性損傷，如急性肺損傷是最常見的繼發(fā)性器官損傷。目前，關(guān)于LI／R導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官損傷的機(jī)制主要集中在自由基的產(chǎn)生及其所造成的氧化損傷和全身炎癥反應(yīng)的失控。肢體缺血時中性白細(xì)胞被激活，當(dāng)缺血肢體再灌注時引發(fā)白細(xì)胞“呼吸爆發(fā)”，產(chǎn)生并釋放大量自由基和顆粒物質(zhì)，加重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，顆粒內(nèi)的蛋白酶消化和分解彈性蛋白及膠原蛋白，造成組織損傷和血管通透性增加。本研究發(fā)現(xiàn)LI／R組肺組織MDA含量和MPO活性顯著升高，說明多形核中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）在肺內(nèi)大量聚集。從而導(dǎo)致組織損傷和血管通透性增加，表現(xiàn)為肺系數(shù)和濕干比明顯升高和PaO2明顯降低，肺組織損傷加重。

LI／R造成遠(yuǎn)隔器官組織白細(xì)胞聚集過程中粘附分子起著重要作用，而P-s是粘附分子選擇素家族的一個重要成員，通常儲存于內(nèi)皮細(xì)胞的分泌顆粒（Weibel-Palade小體）和血小板的α顆粒中。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞和血小板經(jīng)刺激活化后，迅速表達(dá)于細(xì)胞表面，它在介導(dǎo)白細(xì)胞與血管壁接觸發(fā)揮重要的作用。研究表明［2］當(dāng)組織發(fā)生炎癥或遭遇其他損傷時，受炎癥因子的刺激及細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α等的誘導(dǎo)，Weibel-Palade小體和血小板α顆粒迅速與質(zhì)膜融合從而使P-s在內(nèi)皮細(xì)胞和血小板表達(dá)。Kiefmann R等［3］人通過建立內(nèi)毒素兔肺微循環(huán)損傷模型，用免疫組織化學(xué)法和Western blot分析檢測出肺組織的P-s表達(dá)上調(diào)，說明P-s參與ALI。本研究發(fā)現(xiàn)LI／R后4 h肺組織的P-s表達(dá)增加，可能造成PMN在肺血管的黏附、聚集、激活，進(jìn)而加重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程。

近年的研究發(fā)現(xiàn)多次短暫IPC可以增強(qiáng)細(xì)胞對缺血的耐受性，是調(diào)動機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的有效措施［4］。局部IPC對遠(yuǎn)隔臟器的保護(hù)效應(yīng)目前處于探索階段，這種保護(hù)作用據(jù)稱與IPC的延遲保護(hù)作用有關(guān)，已有實驗揭示和神經(jīng)-體液機(jī)制有很大關(guān)系［5］。本研究發(fā)現(xiàn)IPC可以減少肺組織P-s蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減少自由基和脂質(zhì)過氧化損傷。各種損傷的指標(biāo)明顯降低，肺功能明顯改善，損傷減輕。提示預(yù)適應(yīng)對LIR后ALI具有保護(hù)作用。其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ Harkin DW，Barros D’Sa A A，McCallion K，etal.Ischemic preconditioning before lower limb ischemia-reperfusion protects againstacute lung injury［J］.JVascSurg，2002，35（6）：1264-1273.

［2］ Huang J，Upadhyay UM，Tamargo R J，etal.Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia［J］.SurgNeurol，2006，66（3）：232-245.

［3］ Kiefmann R，Heckel K，Schenkat S，etal.Platelet-endothelial cell interaction in pulmonarymicro-circulation：the role of PARS［J］.ThrombHaemost，2004，91（4）：761-770.

［4］ Kloner R A，Jennings R B.Consequences of brief ischemia：stunning preconditioning，and their clinical implications：part l［J］.Circulation，2001，104（24）：2981-2989.

［5］ 楊秀紅，張連元，孫樹勛.一氧化氮與肢體缺血再灌注后肺損傷［J］.國外醫(yī)學(xué)：呼吸系統(tǒng)分冊，2002，22（2）：60-62.