汪 匯，曾祥芝，崔文玉，段 煉△

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，北京100071；2.北京賽德維康醫(yī)藥研究院，北京100039；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，北京100850）

血管新生（angiogenesis）是指產(chǎn)生新的血管或從已存在的血管形成毛細(xì)血管的過程，不僅存在于機(jī)體生長發(fā)育的全過程，更是在創(chuàng)傷修復(fù)、缺血缺氧、炎癥等多種疾病或病理過程中扮演著重要的角色［1］。心肌組織缺血可促進(jìn)血管新生，而膽堿能夠顯著促進(jìn)心肌組織缺血誘導(dǎo)的血管新生，改善心肌缺血損傷，產(chǎn)生分子搭橋（molecular bypass）的生物效應(yīng)［2］。膽堿屬B族維生素，不良反應(yīng)小，毒性??；進(jìn)一步的研究表明膽堿為煙堿受體α7亞型（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）的激動(dòng)劑，血管內(nèi)皮細(xì)胞α7受體參與體內(nèi)血管新生的調(diào)節(jié)，為膽堿調(diào)節(jié)血管新生的分子靶標(biāo)。

煙霧?。╩oyamoya disease）又稱自發(fā)性基底動(dòng)脈環(huán)閉塞癥，是一種原因不明的以雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈及大腦前、中動(dòng)脈起始部動(dòng)脈管腔逐漸狹窄以致閉塞，腦底穿通動(dòng)脈代償性擴(kuò)張為特征的疾病，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程中血管新生發(fā)揮了重要的作用［3］。煙霧病的手術(shù)治療通過直接或間接血管重建等方式形成顱內(nèi)外血管溝通，建立缺血腦區(qū)的側(cè)枝循環(huán)，改善腦缺血損傷［4］。缺血腦區(qū)對(duì)血管新生的促進(jìn)作用，直接影響其治療效果。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞存在α7受體的表達(dá)，因此，研究膽堿對(duì)腦組織缺血誘導(dǎo)血管新生的影響，對(duì)于尋找煙霧病綜合治療新技術(shù)有重要價(jià)值。本研究以雞胚絨毛尿囊膜（chick embryo chorioallantoicmembrane，CAM）血管新生為模型［5］，評(píng)價(jià)膽堿對(duì)血管新生的影響，為研究促進(jìn)血管新生的治療新技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

受精雞卵購自北京藍(lán)風(fēng)家禽養(yǎng)殖有限公司；氯化膽堿購自美國Sigma-Aldrich公司；hVEGF購自美國PerproTech公司；混合纖維素微孔濾膜（孔徑0.45 μm）購自北京升河誠信膜科技發(fā)展中心；打孔器制成直徑0.6 cm的圓片載體，120℃20 min高壓濕熱滅菌，無菌生理鹽水浸泡兩次后備用；LRH-250生化培養(yǎng)箱。

1.2 藥物對(duì)血管新生影響的檢測(cè)

受精雞卵以1‰新潔爾滅清洗后放入37.5℃，60%相對(duì)濕度的孵箱內(nèi)孵育，鈍端向上與蛋托呈45度角，每天翻轉(zhuǎn)至少2次。孵育至第7天時(shí)（滿24 h為一天），在照蛋器指示下，用鉛筆標(biāo)記出雞卵氣室區(qū)域。將雞卵移至超凈工作臺(tái)中，酒精棉球消毒后，用砂輪磨切蛋殼。待磨出一凹痕后，用牙探針的尖端勾開蛋殼，用眼科彎鑷小心夾去蛋殼及殼膜，窗口大小由氣室大小決定，一般距離氣室底邊約0.5 cm。滴加2滴生理鹽水使雞胚絨毛尿囊膜下塌，與卵殼膜分離，去除卵殼膜，暴露雞胚絨毛尿囊膜。

將甲基纖維素微孔濾膜載體置于雞胚絨毛尿囊膜上相對(duì)無血管區(qū)域，用微量移液器向載體上滴入20μl藥物，透明膠帶封口，繼續(xù)孵育3 d，不再翻轉(zhuǎn)。

繼續(xù)孵育至第11天，揭去膠帶，向雞胚絨毛尿囊膜上滴入等量甲醇、丙酮配成的固定液，固定15 min，剪下雞胚絨毛尿囊膜，平鋪于玻片上，用數(shù)碼相機(jī)攝片［6］。以載體為中心，計(jì)數(shù)載體周圍0.3 cm范圍處與計(jì)數(shù)環(huán)相交叉的的血管數(shù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

第一批實(shí)驗(yàn)共分8組（n＝11）：生理鹽水組、hVEGF陽性對(duì)照組（1μg／L）、氯化膽堿 0.01、0.1、1、10、100和 1 000μmol／L組。第二批實(shí)驗(yàn)共分 7組（n＝11）：生理鹽水組、hVEGF陽性對(duì)照組（1μg／L）、氯化膽堿 0.1、0.5、1、5和 10 nmol／L組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 雞胚存活情況

存活雞胚的胚體活動(dòng)活躍，動(dòng)脈血管搏動(dòng)有力，CAM透明，血管呈葉脈狀分布，顏色鮮紅，脈絡(luò)清晰。死亡雞胚的胚體上浮，顏色發(fā)白，活動(dòng)停止，CAM血管顏色淺淡，脈絡(luò)消失。第一批實(shí)驗(yàn)雞胚孵化成功率為 91.0%，第二批實(shí)驗(yàn)孵化成功率為86.2%。

2.2 氯化膽堿對(duì)CAM血管新生的促進(jìn)作用

氯化膽堿 0.01～1 000μmol／L各濃度組和hVEGF組血管數(shù)均多于生理鹽水組，具有顯著性差異（表1，圖1）；氯化膽堿各濃度組與hVEGF陽性對(duì)照組之間相比均無顯著性差異，表明氯化膽堿可促進(jìn)雞胚絨毛尿囊膜血管新生。

Tab.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

Tab.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Vessels counted Control Saline 9 23.67±3.29 Choline 0.01 10 31.90±6.05**（μmol／L） 0.1 10 28.95±4.32*1.0 10 29.15±3.37**10 8 28.13±4.26*100 11 29.45±6.85*1000 9 31.22±7.28*hVEGF（μg／L） 1 7 30.14±4.38 Group Doses n**

Fig.1 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick chorioallantoicmembranes

2.3 氯化膽堿對(duì)促進(jìn)CAM血管新生作用的最低有效劑量濃度

為研究氯化膽堿促進(jìn)血管新生的最低有效濃度，實(shí)驗(yàn)中膽堿濃度從 10 nmol／L進(jìn)一步降至 0.5 nmol／L，結(jié)果顯示氯化膽堿濃度在 0.5～5 nmol／L時(shí)無促進(jìn)血管新生的作用，當(dāng)劑量濃度增至10 nmol／L時(shí)具有促進(jìn)血管生成的作用，新生血管的數(shù)量多于生理鹽水對(duì)照組（表2，圖2）。表明氯化膽堿促進(jìn)血管新生的最低有效濃度為10 nmol／L。

Tab.2 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

Tab.2 Effects of choline chloride on angiogenesis in chick embryo chorioallantoicmembrane（CAM）（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Vessels counted Control Saline 7 33.43±8.62 Choline 0.1 11 35.14±9.46（nmol／L） 0.5 8 30.57±6.88 1 10 33.28±3.64 5 9 37.11±6.97 10 10 47.30±6.65**hVEGF（μg／L） 1 7 41.71±5.12 Group Doses n*

3 討論

CAM是雞胚外的一層膜，主要功能是提供進(jìn)行氣體交換的表面，同時(shí)CAM功能的行使也依賴于致密的血管網(wǎng)的支撐，正是由于雞胚發(fā)育過程中大量尿囊膜血管的形成，為研究血管發(fā)生和形成提供了很好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。由于雞胚早期免疫系統(tǒng)發(fā)育不全，對(duì)所加測(cè)試藥物不會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可在顯微鏡甚至肉眼下直接觀察。同時(shí)，此模型實(shí)驗(yàn)材料易得、操作簡便、實(shí)驗(yàn)周期短、成本較低，因此CAM模型成為研究血管形成的一種理想模型［6］。

本研究應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)膽堿可促進(jìn)血管新生。目前認(rèn)為hVEGF為最強(qiáng)的促進(jìn)血管新生的生物因子，在本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)現(xiàn)氯化膽堿促進(jìn)血管新生的作用強(qiáng)度與hVEGF相當(dāng)。另一方面，其最低有效濃度低，僅為10 nmol／L；有效濃度范圍寬，為 10 nmol／L～1 mmol／L之間，且氯化膽堿各濃度組之間無顯著性差異，提示臨床應(yīng)用膽堿促進(jìn)血管新生的劑量易于控制。

膽堿作為α7受體的配體，可激活和失敏α7受體［7］。一方面，膽堿激活α7受體能夠增加胞內(nèi)Ca2＋釋放、內(nèi)皮細(xì)胞增殖及體外血管索形成，促進(jìn)血管新生和缺血心肌區(qū)側(cè)枝循環(huán)的建立［8］。另一方面，膽堿的有效濃度范圍寬，可能與其可誘導(dǎo)α7受體功能失敏有關(guān)，避免過度激活α7受體，調(diào)控其促進(jìn)血管新生的作用。

應(yīng)用藥物促進(jìn)血管新生，刺激缺血區(qū)小血管生長，促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)形成，目前已經(jīng)成為缺血性心腦血管疾病及其治療技術(shù)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。本研究發(fā)現(xiàn)膽堿促進(jìn)血管新生作用不僅作用強(qiáng)，而且有效劑量范圍寬。由于膽堿的安全性好，毒性低，不良反應(yīng)小，因此，以膽堿作為促進(jìn)血管新生的新技術(shù)具有進(jìn)一步的研究價(jià)值。

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