杜 珍，謝學(xué)淵，張 沂

硝苯地平(nifedipine)屬于電壓依賴(lài)性鈣通道拮抗劑類(lèi)抗高血壓藥物。KCl、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、內(nèi)皮素(endothelins，ET-1)均可誘導(dǎo)血管收縮，也是制備離體高血壓模型的常用藥物，但其作用機(jī)制有所不同。KCl溶液可誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位去極化，使細(xì)胞膜電壓依賴(lài)性鈣通道激活，引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流從而誘發(fā)血管收縮;NE可激動(dòng)血管平滑肌上的α1受體，引起強(qiáng)大的血管收縮作用;ET-1是一種由21個(gè)氨基酸組成的多肽，是迄今為止作用最強(qiáng)和持續(xù)最久的縮血管物質(zhì)，其作用機(jī)制尚不清楚。本研究觀察硝苯地平對(duì)KCl、NE、ET-1誘導(dǎo)離體大鼠胸主動(dòng)脈血管收縮的影響，以對(duì)硝苯地平的作用機(jī)制進(jìn)行深入的探討。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物和藥劑:Wistar大鼠，體質(zhì)量200～250 g，雄性，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，合格證號(hào)SCSK11-00-0006。硝苯地平為石家莊新華制藥廠生產(chǎn)，純度98%;NE由上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn);ET-1由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn);其余試劑均為分析純。(2)儀器:MedLab-U/4CS生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(南京美易科技有限公司);肌肉張力換能器(高碑店市新航機(jī)電設(shè)備有限公司);超級(jí)恒溫器(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠)。(3)Krebs-Henseleit營(yíng)養(yǎng)液(K-H液):組成如下:無(wú)水 CaCl22.52 mmol/L，KH2PO41.18 mmol/L，KCl 4.69 mmol/L，NaCl 118.07 mmol/L，NaHCO325.00 mmol/L，MgSO4·7H2O1.18 mmol/L，Glucose 10 mmol/L。pH 7.4。無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液組分中以EGTA 50 μmol/L取代CaCl2。

1.2 方法 大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)按文獻(xiàn)［1］方法制備。大鼠處死后迅速打開(kāi)胸腔，取出胸主動(dòng)脈，置于4℃ K-H液中，通以95%O2+5%CO2氣體，清洗血液，除去血管壁的脂肪與結(jié)締組織，剪成3～4 mm長(zhǎng)的血管環(huán)。主動(dòng)脈環(huán)通過(guò)換能器與生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)相連，浴槽容積為10 ml，恒溫37℃，持續(xù)通入95%O2+5%CO2氣體，靜止張力1 g，每15 min換1次新鮮的營(yíng)養(yǎng)液，平衡至少1 h且主動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別加入 20 mmol/L KCl、10 μmol/L NE、1 mmol/L ET-1預(yù)收縮主動(dòng)脈環(huán)，待達(dá)到最大幅度后，按累積法向浴槽內(nèi)加入硝苯地平溶液，同時(shí)以等量溶劑作為陰性對(duì)照，觀察硝苯地平的擴(kuò)血管作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以主動(dòng)脈環(huán)最大收縮幅度為100%，計(jì)算硝苯地平的擴(kuò)血管幅度。用graphpad prism 5軟件作圖并統(tǒng)計(jì)，計(jì)算硝苯地平擴(kuò)血管作用的半數(shù)有效劑量EC50、EC50的95%可信區(qū)間、Hillslope值及曲線的r值。

2 結(jié)果

2.1 硝苯地平對(duì)KCl誘導(dǎo)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的影響 麥?zhǔn)显〔蹆?nèi)含鈣營(yíng)養(yǎng)液KCl濃度為20 mmol/L時(shí)，血管迅速收縮，此條件下硝苯地平擴(kuò)血管的 EC50值為 0.072 μmol/L，EC50的 95%可信區(qū)間0.051 ～ 0.101 μmol/L，Hillslope 值為 1.1，r值為0.9651。見(jiàn)圖1。在無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液中，硝苯地平無(wú)對(duì)抗KCl誘導(dǎo)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的作用。

圖1 硝苯地平對(duì)KCl誘導(dǎo)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的作用

2.2 硝苯地平對(duì)NE誘導(dǎo)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的影響 大鼠離體主動(dòng)脈環(huán)在含鈣營(yíng)養(yǎng)液NE 10 μmol/L預(yù)收縮后加入不同濃度的硝苯地平，觀察硝苯地平的擴(kuò)血管作用。結(jié)果顯示，硝苯地平擴(kuò)血管的 EC50值為 5.34 μmol/L，EC50的 95% 可信區(qū)間 3.11 ～9.18 μmol/L，Hillslope值為 1.1，r值為0.9378(圖2)。在無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液中，硝苯地平(0.01 ～10 μmmol/L)無(wú)明顯對(duì)抗 NE 收縮血管的作用。

圖2 硝苯地平對(duì)NE誘導(dǎo)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的作用

2.3 硝苯地平對(duì)ET-1誘導(dǎo)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的影響 在含鈣的營(yíng)養(yǎng)液中，硝苯地平0.01～10 μmol/L呈濃度依賴(lài)地對(duì)抗ET-1誘導(dǎo)的離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮，其 EC50為 0.15 μmol/L，EC50的 95% 可信區(qū)間 0.12 ～ 0.19 μmol/L，Hillslope 值為 0.46，r值為0.9780。見(jiàn)圖3。在無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液中，高濃度硝苯地平(10 μmol/L)無(wú)對(duì)抗ET-1誘導(dǎo)的離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的作用。

圖3 硝苯地平對(duì)內(nèi)皮素誘導(dǎo)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的作用

3 討論

高鉀溶液可誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位去極化，使細(xì)胞膜電壓依賴(lài)性鈣通道激活，引起胞外鈣內(nèi)流從而誘發(fā)血管收縮。由于硝苯地平對(duì)電壓依賴(lài)性鈣通道具有強(qiáng)效高選擇性阻斷作用，所以具有明顯的抗KCl縮血管作用。同時(shí)由于NE的縮血管作用與促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和誘導(dǎo)細(xì)胞外鈣內(nèi)流有關(guān)，因此在含鈣的營(yíng)養(yǎng)液中，硝苯地平具有輕微的擴(kuò)血管作用;而在無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液中，硝苯地平無(wú)明顯對(duì)抗NE收縮血管的作用。

同硝苯地平對(duì)KCl誘導(dǎo)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)收縮的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比，硝苯地平之所以具有強(qiáng)效的抗KCl縮血管作用，與其對(duì)電壓依賴(lài)性鈣通道具有強(qiáng)效高選擇性阻斷作用密不可分。

以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在含鈣的營(yíng)養(yǎng)液中，NE的縮血管效應(yīng)既與其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放有關(guān)，也與其誘導(dǎo)細(xì)胞外鈣內(nèi)流有關(guān)。因此，筆者進(jìn)一步在無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液中觀察硝苯地平對(duì)NE縮血管效應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，在無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液中，NE 0.6 μmol/L迅速誘發(fā)血管收縮，此與促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放有關(guān)。硝苯地平0.01～10 μmol/L無(wú)明顯對(duì)抗NE收縮血管的作用，表明硝苯地平無(wú)對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放誘發(fā)血管收縮的作用。

硝苯地平具有抑制鈣內(nèi)流的作用，而對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放沒(méi)有明顯的影響。高劑量硝苯地平仍不能完全對(duì)抗ET-1誘導(dǎo)的離體主動(dòng)脈收縮，可能與其對(duì)ET-1誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員沒(méi)有明顯的影響有關(guān)。

Liu 等［2］和 Nakajima 等［3］的研究結(jié)果表明，ET-1誘發(fā)血管平滑肌收縮的作用與NE相似，涉及細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流兩種機(jī)制。當(dāng)ET-1與其受體結(jié)合后，通過(guò)G蛋白，激活磷脂酶C，使4，5-二磷酸肌醇磷酯分解為三磷酸肌醇和二脂酰甘油。三磷酸肌醇作用于滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)，使細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)中鈣離子釋放入胞漿，增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度。二脂酰甘油可激活蛋白激酶C，促進(jìn)細(xì)胞靶蛋白質(zhì)的磷酸化，提高細(xì)胞反應(yīng)性。此外，三磷酸肌醇在特異性酶作用下，可促進(jìn)細(xì)胞膜上電壓依賴(lài)性鈣離子通道開(kāi)放，使細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，從而補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)鈣離子貯庫(kù)并激發(fā)血管收縮。在無(wú)鈣離子介質(zhì)中ET-1主要通過(guò)受體后的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)動(dòng)員內(nèi)鈣離子釋放，引起血管收縮，而在含鈣基質(zhì)中，ET-1還可促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，故其縮血管作用涉及促進(jìn)外鈣內(nèi)流和動(dòng)員內(nèi)鈣釋放兩種機(jī)制。所以，同NE相似，硝苯地平在在含鈣的營(yíng)養(yǎng)液中能明顯的對(duì)抗ET-1的縮血管作用;而在無(wú)鈣營(yíng)養(yǎng)液中沒(méi)有明顯的擴(kuò)血管作用。以上結(jié)果提示，電壓依賴(lài)性鈣通道拮抗劑硝苯地平對(duì)內(nèi)鈣釋放誘發(fā)的血管收縮無(wú)明顯對(duì)抗作用，此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4-5］。

［1］ 付彥軍，尤春來(lái)，張效禹，等.去青紫堇堿對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈平滑肌的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2001，15(5):326.

［2］ Liu YA，Ostlund E，F(xiàn)ried G.Endothelin-induced contractions in human placental blood vessels are enhanced in intrauterine growth retardation，and modulated by agents that regulate levels of intracellular calcium［J］.Acta Physiol Scand，1995，155(4):405-414.

［3］ Nakajima T，Hazama H，Hamada E et al.Endothelin-1 and vasopressin activate Ca2+-permeable non-selective cation channels in aortic smooth muscle cells:mechanism of receptor-mediated Ca2+influx［J］.J Mol Cell Cardiol，1996，28(4):707-722.

［4］ 汪海，史大軍，路新強(qiáng)，等.新型鈣通道拮抗劑尼卡地平衍生物的心血管效應(yīng)［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1997，21(1):5-9.

［5］ 何華美，汪海，肖文斌.吡那地爾和硝苯地平對(duì)內(nèi)皮素縮血管作用的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1997，13(6):502-505.