宋新文 汪洋 許瓊 劉炘 彭靜

（武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心藥學(xué)部，湖北 武漢430016）

改良固相萃取高效液相色譜法測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素濃度

宋新文 汪洋 許瓊 劉炘 彭靜

（武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心藥學(xué)部，湖北 武漢430016）

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素濃度的方法。方法：以Hypersil C18柱（4.6 mm× 200 mm，10 μm）為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（9∶91），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm。血清樣品采用固相萃取柱，以含20%乙腈的磷酸二氫鉀溶液為洗脫劑，收集洗脫液直接進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果：萬(wàn)古霉素血清樣品線性范圍為0.8～120 mg/L，低、中、高3種不同濃度（4.33、19.40、77.60 mg/L）回收率分別為100.23%、102.11%、95.68%，日內(nèi)、日間RSD均小于5%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，可滿足臨床萬(wàn)古霉素血藥濃度檢測(cè)的需要。

萬(wàn)古霉素；固相萃??；高效液相色譜法；人血清

萬(wàn)古霉素（Vancomycin）屬糖肽類抗生素，臨床上主要用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的治療[1]。為保證用藥的安全性和有效性，減少耐藥菌的產(chǎn)生，臨床上往往需要檢測(cè)其血藥濃度，根據(jù)血藥濃度檢測(cè)結(jié)果調(diào)整用藥方案[2]。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)萬(wàn)古霉素血藥濃度方法具有十分重要的臨床意義。目前國(guó)內(nèi)臨床上測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度主要是通過(guò)蛋白沉淀法處理血清樣品，取上清液直接進(jìn)入高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)[3-5]。蛋白沉淀法處理血清樣品具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但由于血清蛋白沉淀不完全，大批次檢測(cè)容易堵塞高效液相色譜儀管路。此外，加入的蛋白沉淀劑對(duì)血清樣品的稀釋作用以及蛋白沉淀物對(duì)萬(wàn)古霉素的吸附作用使得其提取回收率較低。張文娟等[6]建立了固相萃?。⊿PE）處理血清樣品，高效液相色譜儀檢測(cè)血清中萬(wàn)古霉素濃度的方法，但該方法所采取的洗脫液（10%冰醋酸-甲醇溶液）需在氮?dú)饬飨滤≌舾桑瑢?shí)際操作中費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)。本研究在此基礎(chǔ)上通過(guò)改變固相萃取洗脫液成分，建立了一種快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的萬(wàn)古霉素血藥濃度檢測(cè)方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，包括G1311C二元色譜泵、G1316A柱恒溫箱（TCC）、G1315D二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、Agilent1260化學(xué)工作站；WH-1微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；LDZ4-0.8A臺(tái)式離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；AB204萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士）；Cleanert C18-SPE柱（規(guī)格：200 mg/支，批號(hào)：BL0061L0709）。

1.2 試藥

萬(wàn)古霉素對(duì)照品（原中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 130360-200301）；乙腈（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T20100423）；無(wú)水磷酸二氫鉀（北京益利精細(xì)化學(xué)品公司，批號(hào)0902020）；磷酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào) 070425）；正?？瞻兹搜澹▽?shí)驗(yàn)室自制）；0.9%氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)100704-201）；20%乙腈-磷酸二氫鉀溶液（配制方法：取色譜乙腈 20 mL與 80 mL磷酸二氫鉀緩沖液混合）；滅菌注射用水（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)11070920）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（4.6 mm×200 mm，10 μm）；流動(dòng)相為乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（9∶91）（取磷酸二氫鉀6.805 g，加入超純水到1 000 mL使溶解，最后用磷酸調(diào)節(jié) pH至 3.2左右，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾），流速 0.8 mL/min；柱溫 25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取萬(wàn)古霉素對(duì)照品12.4 mg于10 mL量瓶中，加滅菌注射用水制成1 240 mg/L儲(chǔ)備液，再用滅菌注射用水稀釋儲(chǔ)備液，配制濃度為9.70、19.38、38.75、77.50、155.00、310.00、620.00 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)水溶液。

2.3 血清標(biāo)本的處理

取血清樣品0.5 mL置SPE小柱，待自然瀝干后用0.9%氯化鈉注射液2 mL上柱進(jìn)行淋洗，棄去淋洗液，將SPE小柱于3 000 r/min離心1 min，精密量取 1 mL 20%乙腈-磷酸二氫鉀溶液上柱進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，取 20 μL直接進(jìn)樣測(cè)定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品和血清樣品色譜圖

分別取空白血清樣品、含萬(wàn)古霉素血清樣品及標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示色譜峰與血清中內(nèi)源性雜質(zhì)峰很好分離，無(wú)干擾峰出現(xiàn)，萬(wàn)古霉素的保留時(shí)間為11 min左右。

圖1 萬(wàn)古霉素血清樣品色譜A空白血清 B含萬(wàn)古霉素血清樣品 C萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)液

2.5 線性關(guān)系考察

取空白血清1.0 mL，依次加入萬(wàn)古霉素系列標(biāo)準(zhǔn)水溶液及儲(chǔ)備液0.1 mL，配制成萬(wàn)古霉素濃度分別為 0.88、1.76、3.52、7.04、14.09、28.18、56.36、112.72 mg/L的系列血清樣品。取以上血清樣品，按1.3項(xiàng)下的方法操作，取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以樣品的濃度（C）對(duì)峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程

C=0.117 2 A－0.205 2（r=0.999 1）

結(jié)果表明，萬(wàn)古霉素血藥濃度在0.8～120 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量濃度為0.8 mg/L。

2.6 方法學(xué)回收率及精密度試驗(yàn)

取空白血清1.0 mL，加入0.1 mL萬(wàn)古霉素對(duì)照水溶液，配制成低、中、高濃度分別為 4.33、19.40、77.60 mg/L萬(wàn)古霉素血清樣品各5份。按2.3項(xiàng)下的方法操作，連續(xù)測(cè)定3 d，以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品實(shí)測(cè)濃度，與配制濃度比較，計(jì)算低、中、高各濃度方法學(xué)回收率及其日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 萬(wàn)古霉素血清方法學(xué)回收率

2.7 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果

10例化膿性關(guān)節(jié)炎患兒，其中，男7例，女3例；年齡最小27天，最大9歲1個(gè)月，分別按40mg/kg.d，分3～ 4次，靜脈滴注的用藥方案治療3 d后采集靜脈血測(cè)定萬(wàn)古霉素血清峰濃度（靜脈滴注完畢后60 min采血）及谷濃度（下次給藥前5～10 min采血），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10例化膿性關(guān)節(jié)炎患兒萬(wàn)古霉素血清濃度

3 討論

本研究在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別采用 10%、20%、 30%乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為洗脫劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10%乙腈-磷酸二氫鉀溶液的洗脫能力有限，只能將約10%的萬(wàn)古霉素從SPE柱上洗脫，20%及30%乙腈-磷酸二氫鉀溶液洗脫能力較好，可以將萬(wàn)古霉素完全洗脫。但30%乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為洗脫液，由于乙腈含量較高，所得色譜峰形前延現(xiàn)象嚴(yán)重，影響峰面積準(zhǔn)確積分。Backes DW等[7]和Farin D等[8]分別采用0.05 M磷酸二氫鉀-乙腈（30∶70）及0.05 M磷酸二氫鉀-乙腈（50∶50）作為洗脫劑，這兩種洗脫劑同樣存在乙腈含量較高問(wèn)題，故本研究采用20%乙腈-磷酸二氫鉀溶液作為洗脫液。實(shí)驗(yàn)表明，所得色譜峰形對(duì)稱性良好，符合實(shí)驗(yàn)要求。宋新文等[9]曾采用20%偏磷酸作為蛋白沉淀劑純化血樣測(cè)定萬(wàn)古霉素血清濃度，但由于蛋白沉淀物對(duì)萬(wàn)古霉素的部分吸附及內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，該方法的最低檢測(cè)限只能達(dá)2 mg/L，對(duì)于萬(wàn)古霉素血清谷濃度的檢測(cè)有一定的局限性。本研究采用SPE法純化血樣，內(nèi)源性雜質(zhì)去除干凈，將最低檢測(cè)濃度提高到0.8 mg/L，尤其適合萬(wàn)古霉素血清谷濃度的測(cè)定。

SPE高效液相色譜法測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度國(guó)內(nèi)少有報(bào)道，國(guó)外文獻(xiàn)[7-8，10]報(bào)道多采用洗脫液蒸干復(fù)溶后進(jìn)樣測(cè)定，實(shí)際操作中洗脫液蒸干極為困難，耗時(shí)較長(zhǎng)。張文娟等[6]曾采用洗脫液（10%醋酸-甲醇溶液作為洗脫劑）蒸干復(fù)溶后進(jìn)樣測(cè)定，但耗時(shí)較長(zhǎng)，需40～60 min才能將洗脫液蒸干?？紤]到萬(wàn)古霉素血清峰濃度和谷濃度比較高，用2倍于血清量的洗脫液將萬(wàn)古霉素從SPE柱上洗脫后直接進(jìn)樣，雖然進(jìn)樣濃度稀釋了1倍，但仍可被高效液相色譜儀檢測(cè)出來(lái)，故本研究采用洗脫液直接進(jìn)樣測(cè)定，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可以滿足萬(wàn)古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究的需求。

[1] 李家泰.臨床藥理學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：1024-1027.

[2] 萬(wàn)古霉素臨床應(yīng)用中國(guó)專家共識(shí) （2011版）[J].中國(guó)新藥與臨床雜志，2011，30（8）：561-573.

[3] 蔣碩民，戚雙雙，王增壽.高效液相色譜法測(cè)定人血漿中萬(wàn)古霉素的濃度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26（11）：1364-1366.

[4] 張虹，方昱，李英，等.反相高效液相色譜法測(cè)定臨床聯(lián)合用藥時(shí)血漿中萬(wàn)古霉素濃度[J].藥物分析雜志，2008，28（4）：591-594.

[5] 林玉仙，蘇煌財(cái).高效液相色譜法測(cè)定萬(wàn)古霉素的血藥濃度[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（8）：637-639.

[6] 張文娟，宋新文，汪洋，等.固相萃取高效液相色譜法測(cè)定萬(wàn)古霉素血藥濃度[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（2）：149-151.

[7] Backes DW，Aboleneen HI，Simpson JA.Quantitation of vancomycin and its crystalline degradation product（CDP-1）in humanserumbyhighperformanceliquidchromatography[J].JPharm Biomed Anal，1998，16（8）：1281-1287.

[8] Farin D，Piva GA，Gozlan I，et al.A modified HPLC method for the determination of vancomycin in plasma and tissues and comparison to FPIA（TDX）[J].J Pharm Biomed Anal，1998，18（3）：367-72.

[9] 宋新文，許瓊，汪洋，等.HPLC法測(cè)定人血清中萬(wàn)古霉素的濃度[J].中國(guó)藥房，2010，21（18）：1663-1665.

[10] Zhang T，Watson DG，Azike C，et al.Determination of vancomycin in serum by liquid chromatography-high resolution full scan mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，857（2）：352-356.

Determination of the Concentration of Vancomycin in Human Serum by Modified Solid Phase Extraction and HPLC

Song Xinwen，Wang Yang，Xu Qiong，Liu Xin，Peng Jing （Pharmaceutical Department of Wuhan Medical Care Center for Women and Children，Hubei Wuhan 430016，China）

Objective：To establish a high performance liquid chromatography method for the determination of the concentration of vancomycin in human serum.Methods：The analysis was conducted with Hypersil C18column (4.6 mm× 200 mm，10 μm).Acetonitrile-potassium dihydrogen phosphate （9∶91）was served as mobile phase，the flow rate was 0.8 mL/min，and the detecting wavelength was at 236 nm.Serum sample was applied to solid phase extraction column.Taking the potassium dihydrogen phosphate solution containing 20%acetonitrile as eluent，and collecting the eluent which was determined by direct injection.Results：The linear range of vancomycin in serum was 0.8～120 mg/L.The recovery rate of low，moderate and high concentrations（4.33，19.40，77.60 mg/L）was 100.23%，102.11%，95.68%respectively.Both intra-day and inter-day RSDs were less than 5%.Conclusion：This method is accurate，sensitive，and simple.It is suitable for the determination of the concentration of vancomycin in human serum.

Vancomycin；Solid Phase Extraction；High Performance Liquid Chromatography；Human Serum

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.02.005

宋新文，男，副主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。通訊作者E-mail：13797028603@126.com