孟繁穎方芳雷力力張志國方洪壯

(1佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院，154003)

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定復(fù)方黃白膠囊中大黃蒽醌類成分的含量

孟繁穎1方芳2雷力力2張志國2方洪壯1

(1佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院，154003)

目的：建立一測(cè)多評(píng)法測(cè)定復(fù)方黃白膠囊中大黃蒽醌類成分的方法。方法：以復(fù)方黃白膠囊為研究對(duì)象，以大黃酚作為內(nèi)參物，計(jì)算大黃酸、大黃素和大黃素甲醚與大黃酚的相對(duì)校正因子；分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法測(cè)定復(fù)方黃白膠囊中上述4種大黃蒽醌類成分的含量。結(jié)果：大黃酸、大黃素及大黃素甲醚與大黃酚間的相對(duì)校正因子分別為0.946、1.105和1.097，相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好。復(fù)方黃白膠囊中大黃成分采用校正因子計(jì)算的含量值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值之間無顯著差異。結(jié)論：該方法可用于復(fù)方黃白膠囊中大黃蒽醌類成分的定量分析。

一測(cè)多評(píng)；復(fù)方黃白膠囊；大黃；蒽醌；相對(duì)校正因子

復(fù)方黃白膠囊（怡康靈膠囊）為佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院的院內(nèi)中藥復(fù)方制劑，主治由肝郁氣滯、脾胃實(shí)熱、肝膽濕熱等癥引起的急、慢性胰腺炎，重癥胰腺炎。該制劑由大黃、黃芩、白芍等7味中藥組成[1]，其中大黃為君藥。一測(cè)多評(píng)法或稱“替代對(duì)照品法”是中藥多成分含量測(cè)定的一種新方法[2-4]，該方法可減少對(duì)照品使用數(shù)目和降低檢測(cè)成本，已被《中國藥典》（2010年版）一部收錄[5]。復(fù)方黃白膠囊現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅測(cè)定黃芩苷單一成分的含量[6]。為更有效地控制該制劑的質(zhì)量，本文應(yīng)用一測(cè)多評(píng)法，以大黃酚為內(nèi)參物，430 nm為測(cè)定波長，計(jì)算大黃素、大黃酸和大黃素甲醚的含量，建立了復(fù)方黃白膠囊中大黃蒽醌類成分的含量測(cè)定方法，并與外標(biāo)法的實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司），包括 G1311A四元泵，G1322真空脫氣機(jī)，G1329自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；Waters Alliance高效液相色譜儀（美國Waters公司），包括2695溶劑和樣品管理系統(tǒng)，2996 DAD。色譜柱：Agilent SB C18、XDB C18、Extend C18，規(guī)格均為（4.6 mm×250 mm，5 μm）。大黃酚（110796-200310）、大黃素（110756-200110）、大黃酸（110757-200206）供含量測(cè)定用；大黃素甲醚（110756-200408）供鑒定用，經(jīng)峰面積歸一化法測(cè)定，純度為97.7%。上述4種大黃蒽醌對(duì)照品購自原中國藥品生物制品檢定所。流動(dòng)相甲醇為色譜醇，其他試劑均為分析純。復(fù)方黃白膠囊由佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸水（82∶18），流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長430 nm，進(jìn)樣量20 μL。理論板數(shù)按大黃酚計(jì)不低于4 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，配置成 96、12、16、18 mg/L的混合貯備液，保存于4℃冰箱中。用時(shí)精密量取適量體積用甲醇稀釋成混合對(duì)照液。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方黃白膠囊內(nèi)容物 1 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，加熱回流1 h，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，蒸干，殘?jiān)尤?.5 mol/L鹽酸20 mL，回流提取30 min，放冷，再加入三氯甲烷20 mL，加熱1 h，放冷，移至分液漏斗中，靜置，取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷萃取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按復(fù)方黃白膠囊制備工藝制取缺大黃的陰性樣品，按 2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 色譜峰的定位

取混合貯備液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度使成混合對(duì)照液。分別取供試品溶液、混合對(duì)照液及陰性對(duì)照液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，同時(shí)記錄各色譜的230～ 480 nm的數(shù)據(jù)。各溶液430 nm的色譜圖見圖1。提取對(duì)照品色譜峰二維數(shù)據(jù)的光譜，作為標(biāo)準(zhǔn)光譜，分別計(jì)算其與供試品溶液部分保留時(shí)間光譜間的相關(guān)系數(shù)，并繪制相應(yīng)的光譜相關(guān)色譜曲線[7]，見圖2?？芍?，供試品溶液色譜保留時(shí)間5.90、8.74、11.78、15.61 min處的色譜峰分別為大黃酸、大黃素，大黃酚和大黃素甲醚，各色譜峰均為純峰。

圖1 對(duì)照品和樣品的HPLC圖A大黃蒽醌對(duì)照品；B復(fù)方黃白膠囊供試品；C復(fù)方黃白膠囊大黃陰性供試品1大黃酸；2大黃素；3大黃酚；4大黃素甲醚

2.4 線性與范圍

分別精密移取混合貯備液1、3、5、6、8 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成系列濃度的混合對(duì)照液，按2.1色譜條件測(cè)定混合儲(chǔ)備液及系列濃度混合對(duì)照液。以進(jìn)樣量X（μg）對(duì)測(cè)得的峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚的回歸方程及線性范圍，見表1。4種大黃蒽醌類成分在所測(cè)定的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 供試液中各成分的光譜相關(guān)色譜A大黃酸 B大黃素 C大黃酚 D大黃素甲醚

表1 復(fù)方黃白膠囊中4種蒽醌類成分的線性關(guān)系（n=6）

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄4種蒽醌類成分的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的RSD分別為0.2%、0.4%，0.4%和0.3%，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于配制后的0、2、4、8、12和24 h進(jìn)樣分析，記錄 4種成分的峰面積值，計(jì)算RSD。大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚峰面積的 RSD分別為 0.5%、1.0%，0.9%和0.9%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別測(cè)定，記錄4種成分峰面積，并計(jì)算各自的RSD。大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚的RSD分別為1.1%，1.8%，1.6%，1.3%。結(jié)果表明，測(cè)定重復(fù)性良好。

2.8 相對(duì)校正因子

2.8.1 校正因子確定 取混合貯備液及2.4項(xiàng)下的各混合對(duì)照液，分別按2.1色譜條件測(cè)定各成分的峰面積。根據(jù)相對(duì)校正因子公式[3]，分別計(jì)算大黃酸、大黃素、大黃素甲醚與內(nèi)參物大黃酚的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表2。

表2 大黃中蒽醌類成分相對(duì)校正因子

2.8.2 校正因子重現(xiàn)性 取混合貯備液，加甲醇等量稀釋。分別于兩臺(tái)儀器3種色譜柱上各進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定各成分的峰面積，按公式計(jì)算大黃酸、大黃素、大黃素甲醚對(duì)大黃酚的相對(duì)校正因子，所得的相對(duì)校正因子及RSD見表3，結(jié)果顯示，不同的儀器及不同的色譜柱所得的相對(duì)校正因子較接近。

表 3 不同儀器和色譜柱測(cè)得相對(duì)校正因子 （n=3）

2.9 回收率

取已知含量的同一批號(hào)的復(fù)方黃白膠囊內(nèi)容物6份，各約0.5 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入對(duì)照品混合貯備液3 mL，再精密加入甲醇20 mL，按2.2.2項(xiàng)下自“稱重”起操作，制備供試品溶液，按 2.1色譜條件測(cè)定，以一測(cè)多評(píng)法計(jì)算各成分的加樣回收率。結(jié)果大黃酚、大黃酸，大黃素及大黃素甲醚的4種成分的加樣回收率分別為98.9%，100.6%，100.4%，99.7%；RSD分別為1.4%、1.6%，1.2%和1.8%，表明該方法有很好的準(zhǔn)確性。

2.10 樣品測(cè)定

取6個(gè)不同批號(hào)的復(fù)方黃白膠囊，分別制備供試品溶液。精密量取混合貯備液6 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度使成混合對(duì)照液。將制備好的供試品溶液和混合照液，分別進(jìn)樣測(cè)定。分別用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法計(jì)算大黃酚、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚4種成分的含量，結(jié)果見表4。對(duì)表4中不同方法測(cè)得的大黃素、大黃酸和大黃素甲醚含量數(shù)據(jù)進(jìn)行成對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)法測(cè)定的復(fù)方黃白膠囊中蒽醌類成分的結(jié)果在準(zhǔn)確度上與外標(biāo)法無差異（α=0.1）。

表4 不同方法測(cè)得復(fù)方黃白膠囊中大黃蒽醌類成分的含量（mg/g）

3 討論

復(fù)方黃白膠囊中大黃蒽醌類成分以結(jié)合型糖苷和游離型苷元兩種形式存在，為了增加測(cè)定的靈敏度，在方法建立和樣品測(cè)定時(shí)，均先將蒽醌的結(jié)合型糖苷水解成苷元后，測(cè)定各蒽醌苷元成分的含量。采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定含大黃中藥制劑中的蒽醌成分，現(xiàn)僅見于三黃片的測(cè)定[8]，測(cè)定波長為254 nm。復(fù)方黃白膠囊所含化學(xué)成分復(fù)雜，本研究選用的測(cè)定波長為430 nm，該波長為大黃蒽醌的吸收峰之一，在此波長下可消除復(fù)方黃白膠囊中共存的其他成分對(duì)測(cè)定的干擾。結(jié)果表明，本研究所建立的方法可用于復(fù)方黃白膠囊中大黃蒽醌類成分的定量。

[1] 黃展.怡康靈膠囊主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2007，30（3）：47-48.

[2] 王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測(cè)多評(píng)法”中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式方法學(xué)研究[J].中國中藥雜志，2006，31（23）：1925-1928.

[3] 王智民，錢忠直，張啟偉，等.一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南[J].中國中藥雜志，2011，36（6）：657-658.

[4] 何歡，馬雙成，張啟明，等.HPLC替代對(duì)照品法同時(shí)測(cè)定莪術(shù)油及其注射液中6種成分的含量[J].藥物分析雜志，2009，29（11）：1892-1899.

[5] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：285.

[6] 董麗華，張志國，于春艷.高效液相色譜法測(cè)定怡康靈膠囊中黃芩苷的含量[J].中國藥師，2006，9（8）：777-778.

[7] Hu Y，Liang YZ，Li BY，et al.Multicomponent spectral correlative chromatography applied to complex herbal medicines[J].J Agric Food chem，2004，52（26）：7771-7776.

[8] 王鈺瑩，馮偉紅，楊菲，等.“一測(cè)多評(píng)”法測(cè)定三黃片中的大黃蒽醌類成分[J].中國中藥雜志，2012，37（2）：212-217.

Content Determination of Rhubarb Anthraquinones in Compound Huangbai Capsules by QAMS

Meng Fanying1，F(xiàn)ang Fang2，Lei Lili2，Zhang Zhiguo2，F(xiàn)ang Hongzhuang1（1 College of Pharmacy of Jamusi University，Heilongjiang Jiamusi 154007，China；2 The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，154003）

Quantitative Analysis of Multiple Components with A Single Maker（QAMS）；Compound Huangbai Capsules；Rhubarb；Anthraquinone；Relative Correlation Factor

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.02.008

2012-06-04）

黑龍江省教育廳科技研究項(xiàng)目（12521547）；佳木斯大學(xué)青年基金項(xiàng)目（S2011-032）

孟繁穎，女，碩士。研究方向：藥物質(zhì)量控制方法學(xué)。

方洪壯，男，教授。研究方向：計(jì)算藥物分析、中藥分析。通訊作者E-mail:fhz-chjms@sohu.com

ABSTRCT Objective:To establish a quantitative method for the quantitative analysis of multiple components with a single maker（QAMS）to determine the content of rhubarb anthraquinones in compound huangbai capsules.Methods:Compound huangbai capsules were taken as the research object.Chrysophanol was used as the internal reference and the relative correlation factors（RCFs）of rhein，emodin and physcion to chrysophanol were calculated.The contents of these four anthraquinones were determined by the external standard method and QAMS respectively.Results:The RCFs of rhein，emodin and physcion to chrysophanol were 0.946，1.105 and 1.097 respectively，indicating good reproducibility.No significant differences between the quantitative results of the two methods were observed.Conclusion:The established QAMS method can be applied to the quantitative determination of rhubarb anthraquinones in compound huangbai capsules.