朱祥瑞，章本學(xué)，楊逸文，蔡志偉，占鵬飛

（1.浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江杭州 310058；2.安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司，浙江湖州 313300；3.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313060）

桑椹及桑椹酒白藜蘆醇的含量變化

朱祥瑞1，章本學(xué)2，楊逸文2，蔡志偉2，占鵬飛3

（1.浙江大學(xué)應(yīng)用生物資源研究所，浙江杭州 310058；2.安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司，浙江湖州 313300；3.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313060）

為探索人為控制提高桑椹與桑椹酒白藜蘆醇含量，采用UV-C照射桑椹，于20±1℃避光放置后，進(jìn)行發(fā)酵。試驗(yàn)結(jié)果顯示：照射強(qiáng)度為0.6～3.6 KJ/m2的UV-C照射桑椹后避光放置，均可不同程度誘導(dǎo)白藜蘆醇產(chǎn)生；添加果膠酶能提高桑椹酒白藜蘆醇的含量，最高可以提高56%；桑椹酒發(fā)酵至96 h時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最大值。

桑椹；桑椹酒；白藜蘆醇；控制

桑椹（Fructusmori）因含有多種營養(yǎng)成分，如?；ㄇ嗨?、蕓香苷、胡蘿卜素、維生素，多種礦物質(zhì)和微量元素等，逐漸被消費(fèi)者認(rèn)可和接受。還因桑椹含有白藜蘆醇等功能性成分，而受到重視［1］。

隨著對(duì)桑椹研究的深入及大眾對(duì)桑椹產(chǎn)品保健功能的認(rèn)知和接受，相關(guān)的桑椹產(chǎn)品，如桑果酒、桑果凍、桑椹膏、桑椹紅色素等，生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，其中桑椹酒是最具影響力和發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)品。

白藜蘆醇（resveratrol）是桑椹酒產(chǎn)品的一個(gè)重要的功能性成分，也是桑椹酒市場競爭力的一個(gè)重要因素。為此，研究桑椹酒釀制前后，桑椹中白藜蘆醇的含量變化以及人為調(diào)控的方法，對(duì)于保持和有限提高桑椹酒中白藜蘆醇含量，有著重要意義。本文就桑椹采摘后和桑椹酒釀制中的白藜蘆醇含量的變化，以及人為調(diào)節(jié)的方法進(jìn)行了小結(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

桑椹：大10成熟果實(shí)，2013年5月中旬采摘于安吉縣超龍蠶業(yè)發(fā)展有限公司馬村桑園。

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品：美國Sigma Chemical Co．LTD產(chǎn)品。

乙腈：美國霍尼韋爾公司（Honeywell）色譜級(jí)產(chǎn)品。

酵母：LAFFORT F33，法國LAFFORT公司產(chǎn)品。

果膠酶：法國LAFFORT果酒專用果膠酶。

1.2 儀器

LC-6A高效液相色譜儀、UV檢測器：日本島津公司。

色譜柱：Hypersil ODS柱（250 mm×416 mm，μm），美國Thermo Scientific公司。

分析天平：賽多利斯BSA124S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

發(fā)酵罐：RAT-5型5 L雙層玻璃反應(yīng)釜，予華儀器有限公司。

紫外燈管：UV-C紫外燈管（15W），飛利浦公司。紫外線檢測儀：北京師范大學(xué)光電儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 桑椹紫外線處理

將裝有UV-C（200～275 nm，中心波長254 nm）紫外燈管的照射架放置在操作臺(tái)上。通過調(diào)節(jié)燈管到操作臺(tái)面的距離，以確定紫外輻照的強(qiáng)度為2 w/m2［2］。照射輻照強(qiáng)度用紫外檢測儀測定。

選取成熟適度的大10桑椹，放置與操作臺(tái)上，攤薄，能使紫外光照射到每顆桑椹。分別照射0、5、10、15、20、25、30 min，UV-C的照射強(qiáng)度分別為0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6 KJ/m2。每隔2 min，翻動(dòng)桑椹1次，使紫外線均勻照射到桑椹。紫外線照射后的桑椹于培養(yǎng)箱（20±1℃）中避光放置24 h［3～4］。

在培養(yǎng)箱中放置的桑椹，每隔4 h取樣1次，樣品速凍后冰箱保存。

1.3.2 桑椹酒釀制方法

（1）酵母準(zhǔn)備：將LAFFORT F33酵母緩慢的加入到其10倍質(zhì)量的37℃的熱水中，攪拌溶解，活化，靜置2 min，備用。

（2）原料準(zhǔn)備：將紫外線照射25 min（3 KJ/m2）后的桑椹樣品，解凍后，用破碎機(jī)破碎，投入發(fā)酵罐，添加LAFFORT果酒專用果膠酶，用量為0.2 g/L，并適量添加亞硫酸鹽溶液，添加量為20 mg/L，充分?jǐn)嚢琛?duì)照，不添加果膠酶。

（3）糖酸度調(diào)整：根據(jù)桑椹本身糖度以及桑椹酒酒度（10°）要求，添加一定量的食糖，調(diào)整桑椹汁糖度至250 g/L。按桑椹酒要求，調(diào)整酸度至6 g/L。

（4）發(fā)酵：活化后的酵母，按一定比例用量，加入到桑椹汁中充分?jǐn)嚢?，?0～24℃下發(fā)酵，當(dāng)殘?zhí)切∮?.0 g/L時(shí)，結(jié)束主發(fā)酵［5］。

發(fā)酵過程中，每隔24 h抽樣，進(jìn)行白藜蘆醇分析。

1.3.3 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品2.5 mg，用無水乙醇溶解并定容于25 ml容量瓶中。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m l，用無水乙醇定容于100 m l容量瓶中，搖勻，得濃度分別為1、2、3、4、5 mg/L白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)系列。以無水乙醇為空白對(duì)照，各進(jìn)樣10μl，在306 nm波長下進(jìn)行HPLC分析。以樣品白藜蘆醇量為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），計(jì)算曲線方程（n=5）和相關(guān)系數(shù)（R2）。

1.3.5 桑椹及桑椹酒試樣的制備

（1）UV-C照射桑椹不同時(shí)間后的樣品，解凍、高速勻漿，微孔過濾，收集濾，待檢測。

（2）添加不同量酵母的桑椹汁，開始發(fā)酵后，每24 h取樣1次，樣品離心（6000 r/min，15 min）后，冰箱-40℃保存，待檢測。對(duì)照樣品（不添加果膠酶），處理相同。

1.3.6 桑椹和桑椹酒試樣的HPLC測定

（1）色譜條件

流動(dòng)相：乙腈∶水（35∶65）

檢測波長：306 nm

柱溫：室溫

流速：1m l/min進(jìn)樣：10μl

（2）樣品分析

在與測定白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品相同的條件下，測試桑椹和桑椹酒試樣的白藜蘆醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的HPLC圖譜見圖1。

以白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

2.2 紫外線對(duì)桑椹白藜蘆醇的誘導(dǎo)

桑椹經(jīng)UV-C不同強(qiáng)度照射，經(jīng)遮光保存一定時(shí)間后，桑椹內(nèi)白藜蘆醇含量變化見圖3。

圖3顯示，未經(jīng)紫外線照射的桑椹，從0～4 h，白藜蘆醇含量稍有增加，隨后便開始下降。經(jīng)不同強(qiáng)度紫外線照射后，避光保存0～16 h，桑椹白藜蘆醇含量均有一定程度的增加，16 h后開始下降；紫外線照射強(qiáng)度為3.6 KJ/m2，桑椹白藜蘆醇產(chǎn)生的量最多，最高達(dá)16.3mg/L；遮光放置0～24 h，桑椹白藜蘆醇均有增加，其中0～12 h，白藜蘆醇含量的增加呈上升趨勢，12 h后，含量呈下降。

以上情況說明，經(jīng)紫外線照射后的桑椹，避光放置12 h后，白藜蘆醇含量比初始值有一定的上升；紫外線照射強(qiáng)度，在0.6 KJ/m2～3.6 KJ/m2范圍內(nèi)，隨著強(qiáng)度的增加，白藜蘆醇含量都有所增加。與未經(jīng)紫外線照射的桑椹比較，白藜蘆醇含量均有一定的上升。

圖1 白藜蘆醇標(biāo)樣HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of resveratrolstandard sample

圖2 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of resveratrol

圖3 不同強(qiáng)度紫外線照射后桑椹白藜蘆醇含量的變化Fig.3 Resveratrol content change ofmulberry fruitafter UVC dosagesirradiation

2.3 桑椹酒發(fā)酵條件的選擇

桑椹汁添加一定量的酵母后，在20～24℃下進(jìn)行主發(fā)酵。

酵母添用量與桑椹酒發(fā)酵液中糖含量的關(guān)系見圖4。

圖4 不同酵母用量與糖含量的關(guān)系Fig.4 The relation between the amountof yeastand the sugar content

從圖4可知，酵母用量為250 mg/L的樣品，發(fā)酵到第4 d時(shí)，糖含量剩下4.7 g/L，主發(fā)酵基本完成；其他的也接近5 g/L；發(fā)酵至第5 d，各組的含糖量均下降至5 g/L以下。其中，200 mg/L酵母用量的發(fā)酵效果，非常接近于250mg/L的效果。

酵母添用量與桑椹酒發(fā)酵液中酒精含量的關(guān)系見圖5。

圖5 不同酵母用量與乙醇含量的關(guān)系Fig.5 The relation between the amount of yeast and the ethanol content

從圖5可知，發(fā)酵至第4 d，乙醇產(chǎn)生量開始變緩。酵母添加量為200 mg/L與250 mg/L的效果接近，乙醇含量分別達(dá)到9.9%和10.1%。結(jié)合對(duì)發(fā)酵酸的考察以及經(jīng)濟(jì)的考慮，認(rèn)為200 mg/L酵母用量比較合適。

2.4 桑椹酒發(fā)酵條件對(duì)白藜蘆醇含量的影響

未添加果膠酶發(fā)酵至第4 d的桑椹酒白藜蘆醇的HPLC圖譜，見圖6。

圖6 桑椹酒白藜蘆醇HPLC圖譜（發(fā)酵第4 d）Fig.6 HPLC chromatogram of resveratrol inmulberry wine（4th day of fermentation）

每24 h抽取發(fā)酵樣品，測定白藜蘆醇含量，結(jié)果見圖7。

圖7 果膠酶對(duì)桑椹酒白藜蘆醇含量的影響Fig.7 Effect of pectinase on resveratrol content in mulberry wine

圖7顯示桑椹酒中的白藜蘆醇含量隨著發(fā)酵，有一定程度的提高；發(fā)酵到第4 d時(shí)，白藜蘆醇含量到達(dá)最高；添加果膠酶有利于桑椹酒中白藜蘆醇含量的提高，最高的達(dá)3.9 mg/L，比未添加果膠酶的2.5mg/L，增加了1.4mg/L，增幅達(dá)56%。

3 結(jié)果與討論

3.1 桑椹采摘后經(jīng)紫外線UV-C照射后，于避光放置一定時(shí)間后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生白藜蘆醇

紫外線照射是一種非生物脅迫因子。根據(jù)其波長，紫外光可分為UV-A（315～390 nm），可以全部通過臭氧層，達(dá)到地面；UV-B（280～315 nm）部分被臭氧層吸收，部分到達(dá)地面；而UV-C（200～275 nm），則幾乎全部被臭氧層吸收。這意味著UC-A和UC-B對(duì)于桑椹等植物，已習(xí)以為常，沒有誘導(dǎo)合成白藜蘆醇的作用。而UV-C在自然條件下，因?yàn)閯┝糠浅Ｐ?，?duì)桑椹合成白藜蘆醇也不起作用，因此，通過人工提高UV-C的照射劑量，可以誘導(dǎo)桑椹合成白藜蘆醇［2］。

3.2 紫外線照射強(qiáng)度以及避光放置時(shí)間對(duì)白藜蘆醇的誘導(dǎo)有相關(guān)性

UV-C照射強(qiáng)度越強(qiáng)，誘導(dǎo)桑椹產(chǎn)生的白藜蘆醇越多。

照射后，避光放置12 h內(nèi)，白藜蘆醇含量增加，隨后下降。為此，利用紫外線照射誘導(dǎo)產(chǎn)生白藜蘆醇，需在避光12 h內(nèi)使用。鑒于實(shí)際條件，本實(shí)驗(yàn)采用3 KJ/m2UV-C照射后，避光放置了20 h后的桑椹為原料進(jìn)行發(fā)酵，白藜蘆醇含量沒有達(dá)到理想水平。

3.3 使用果膠酶釀制桑椹酒，控制發(fā)酵時(shí)間，可以提高白藜蘆醇含量

添加0.2 g/L釀酒專用果膠酶，可以提高桑椹酒白藜蘆醇的含量；而且，發(fā)酵96 h后白藜蘆醇含量達(dá)到最大值。為此，可以通過控制酵母量的添加，進(jìn)而控制發(fā)酵完成的時(shí)間，以求桑椹酒白藜蘆醇含量達(dá)到最大值。

3.4 桑椹酒發(fā)酵時(shí)，酵母添加量與主發(fā)酵完成有一定的關(guān)系

在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，控制酵母添加量為200 mg/L為比較合適的用量，可以使得主發(fā)酵基本完成，同時(shí)可以保證白藜蘆醇含量處于一個(gè)比較高的位置。

［1］劉兆平，霍軍生.白藜蘆醇生物作用研究新進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)），2O02，（29）3：146～147.

［2］榮瑞芬，馮雙慶，戴蘊(yùn)青.短波紫外線照射對(duì)葡萄采后發(fā)病率及白藜蘆醇化合物的影響［J］.保鮮與加工，2005，28（3）：8～9.

［3］Langcake P，Pryce R J.The production ofresveratrol an d the viniferins by grapevines in response to ultraviolet irradiation［J］.Phyto-chem istry，1977，16：1193～1196.

［4］李景明，馬麗艷，劉艷娜.葡萄采后紫外線（UV）處理對(duì)白藜蘆醇的誘導(dǎo)作用［J］，中外葡萄與葡萄酒，2004.4：16～19.

［5］馬佩選.葡萄酒質(zhì)量與檢驗(yàn)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2002.

Content Changes of Resveratrol in Mulberry Fruit and Mulberry Wine

ZHU Xiang-rui1,ZHANG Ben-xue2,YANG Yi-wen2,CAIZhi-wei2,ZHAN Peng-fei3
（1.Institute ofapplied bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China; 2.AnjiChaolongSericultural Development Company,Anji 313300 Zhejiang,China; 3.Huzhou Academy ofAgricultural Science,Huzhou 3130600 Zhejiang,China）

To investigate the content change of resveratrol in fresh mulberry fruit and mulberry wine,the experimentwas carried out:UV-C irradiated mulberry fruit for severalminutes,and storage in dark place at 20±1℃,then ferment.The experiment result showed that the intensity of radiation tomulberry fruit from 0.6 to 3.6 KJ/m2and keep it in darkness, it could inducedresveratrol.The experiment also indicatedthat added pectinase,it could increased resveratrol content in mulberry wine,themaxwas raised 65%;when ferment for 96 h,the resveratrol content reached highest.

freshmulberry fruit;mulberrywine;resveratrol;control

S886.9

A

0258-4069［2013］03-032-04

湖州市科技局攻關(guān)計(jì)劃農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（編號(hào)：2012C22154）

朱祥瑞（1957-），男，博士，副教授。主要從事蠶業(yè)資源開發(fā)利用的教學(xué)科研和推廣。E-mail：xrzhu@zju.edu.cn