許耀照，孫萬倉，曾秀存,，李彩霞，周喜旺

(1.河西學院，甘肅 張掖 734000； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅 蘭州 730070； 3.天水市農(nóng)業(yè)科學研究所，甘肅 天水 741001)

我國約有667萬hm2鹽堿地[1]，土壤鹽化與堿化往往相伴發(fā)生，長期以來人們將土壤可溶性鹽分的增加籠統(tǒng)地稱為“土壤鹽堿化”[2]。土壤鹽化以土壤鹽度升高為主要特征，堿化以土壤pH升高為主要特征[3]，土壤鹽漬化已成為當今世界農(nóng)業(yè)發(fā)展所面臨的重要問題[4]，在我國主要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)區(qū)河西走廊鹽漬土面積達179.8萬hm2[5]，且土壤偏堿[6]，開發(fā)利用河西走廊的鹽堿地可以擴大耕地面積，提高農(nóng)作物總產(chǎn)量。

近10年來，我國食用植物油的進口量持續(xù)增加，總進口食用植物油占中國食用植物油供給的62.41%[7]，因此，在耕地有限的情況下，如何增加食用植物油自給顯得尤為重要。油菜(Brassicacampestris)屬于十字花科(Brassicaceae)蕓薹屬(Brassica)，作為世界第3大油料作物和我國第1大食用植物油料作物[8-10]，種植范圍非常廣泛，是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)植物油及優(yōu)質(zhì)飼料蛋白的重要作物。油菜一般被認為是中度耐鹽作物[10]。隨著冬油菜種植北移的成功[11]，冬油菜在甘肅河西地區(qū)已成為一種重要的經(jīng)濟作物。目前關(guān)于鹽堿混合脅迫的研究已在小麥(Triticumaestivum)[12-13]、野生大豆(Glycinesoja)[14]、甜高粱(Sorghumdochna)[15]和水稻(Oryzasativa)[16-17]等作物方面有報道，但關(guān)于油菜耐鹽堿的研究多集中于NaCl等單一鹽脅迫后一些生理生化指標的研究[9-10,18]，而關(guān)于復合鹽堿對冬油菜脅迫的主導因素研究很少。為了充分利用河西走廊的鹽堿地種植冬油菜，增加食用植物油的產(chǎn)量，本研究依據(jù)河西走廊土壤鹽堿特性，將中性鹽NaCl和Na2SO4及堿性鹽NaHCO3和Na2CO3按不同摩爾比例混合，模擬20種鹽度和pH值不同的鹽堿條件，對冬油菜“隴油6號”(Brassicacampestriscv.Longyou No.6)的種子和幼苗進行鹽堿混合脅迫處理，測定種子發(fā)芽率、根系活力和葉片細胞膜透性等6項脅變指標，旨在探討鹽堿混合條件對冬油菜“隴油6號”脅迫作用的主導因素，為河西走廊鹽堿地種植經(jīng)濟作物冬油菜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料 超強抗寒冬油菜品種“隴油6號”由甘肅農(nóng)業(yè)大學遺傳育種教研室提供。試驗于2010年3月到5月在河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院遺傳學實驗室中進行。

1.2試驗設(shè)計 鹽堿溶液的配制參照姚帥男等[19]的方法并加以改進，試驗設(shè)計為4種鹽分組成[A因素，以堿性鹽所占摩爾比例由小到大分為4組。NaCl、Na2SO4、Na2CO3和NaHCO3的依次鹽分組成摩爾比為A1(1∶9：9∶1)、A2(1∶1∶1∶1)、A3(9∶1∶1∶9)和A4(1∶1∶9∶9)]和5種鹽濃度，10、20、30、40和50 mmol·L-1的雙因素處理，總計20種鹽度和pH值不同的鹽堿組合。各處理液的pH值、鹽度、Na+、Cl-、SO42-、HCO3-和CO32-的濃度根據(jù)鹽處理液的實際鹽分組成得出(表1)。

表1 不同鹽處理液各脅迫因素的濃度Table 1 Density of stress factors for various salt treatments solution

1.3材料培養(yǎng)及測定項目 種子萌發(fā)：2010年3月6日挑選顆粒飽滿、大小一致的“隴油6號”種子，用 0.1 % HgCl2消毒10 min，蒸餾水沖洗4次，用濾紙吸干種子外附水分，將種子置于不同鹽堿混合處理溶液中浸種6 h，分別置于發(fā)芽床上，每個培養(yǎng)皿(Φ=12 cm)中放50粒種子，加入不同鹽堿混合濃度的培養(yǎng)液10 mL，每個處理重復3次，用蒸餾水處理做對照(CK)，然后將培養(yǎng)皿置于智能光照培養(yǎng)箱GZH-268B中，在25±1℃條件下避光培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每天定時觀察，用稱重法補充所蒸發(fā)的水分，每個培養(yǎng)皿補充一致，從處理的第2天開始，每天定時記錄種子的發(fā)芽情況，連續(xù)統(tǒng)計7 d后，計算種子發(fā)芽率。

幼苗培養(yǎng)：2010年3月12日將消毒避光萌發(fā)的“隴油6號”種子，待胚根露出后播種至裝有蛭石的花盆(Φ=15 cm)中，待兩葉一心時，挑選萌發(fā)整齊，生長良好的幼苗，每盆5株繼續(xù)培養(yǎng)。苗齡28 d時，選取長勢均勻的63盆，隨機分成21組，進行鹽堿混合脅迫處理，每組3次重復，處理于18:00-20:00進行。以相應(yīng)混合鹽堿濃度溶液處理，每盆300 mL處理液分3次灌透，以保證油菜幼苗根系完全處于鹽堿脅迫中，以蒸餾水處理為對照(CK)，脅迫處理7 d后進行相關(guān)指標測定。取幼苗生長部位一致的第2片葉測定細胞質(zhì)膜透性[20]，用硫代巴比妥酸(TBA)法測葉片丙二醛含量[20]，用磺基水楊酸法測定葉片脯氨酸含量[20]，用考馬斯亮藍G-250法測定葉片可溶性蛋白含量[20]，取幼苗根系生長部位一致的主根用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定根系活力[20]。

1.4數(shù)據(jù)分析 用CO32-、pH值、鹽度和Cl-4因素代表所有的脅迫因素進行多元線性回歸統(tǒng)計分析。以CO32-、pH值、鹽度和Cl-為自變量，并設(shè)X1=CO32-、X2=Cl-、X3=pH、X4=鹽度,X=b1X1+b2X2+b3X3+b4X4，b1～b4為回歸系數(shù)；用發(fā)芽率、細胞膜透性、根系活力、丙二醛、脯氨酸和可溶性蛋白含量6項脅變指標為因變量Y，按公式Y(jié)=a+X對6項脅變指標進行多元回歸分析，計算各自變量的標準回歸系數(shù)b1′～b4′，以標準回歸系數(shù)絕對值的大小直接反映脅迫因素對脅變指標的影響程度，并計算全相關(guān)系數(shù)的平方(R2)以評價各回歸方程的回歸效果。

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003軟件進行處理和繪圖，用DPS v 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進行相關(guān)性分析，試驗數(shù)據(jù)為3次重復的平均值并進行Duncan氏新復極差法統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1不同鹽分組成和不同鹽濃度處理對脅變指標的影響 當鹽處理液的濃度由10 mmol·L-1遞增到50 mmol·L-1時，不同鹽分組成的處理液A1～A4均降低了“隴油6號”種子發(fā)芽率、幼苗根系活力和葉片可溶性蛋白含量，增加了幼苗葉片細胞膜透性、丙二醛和脯氨酸的含量。在同一鹽處理濃度下不同鹽分組成的處理液之間各脅變指標的變化達顯著性差異(P<0.05)(表2)。

隨著鹽分組成由A1到A4，“隴油6號”種子發(fā)芽率、幼苗根系活力和葉片可溶性蛋白含量大體降低，幼苗葉片細胞膜透性和脯氨酸含量大體增大，不同處理間差異顯著(P<0.05)。當鹽分組成為A1時，隨著鹽處理液濃度由10 mmol·L-1遞增到50 mmol·L-1時，“隴油6號”種子發(fā)芽率由99.33%降低到96.00%、幼苗根系活力由120.76 μgTTF·g-1·h-1降低到94.56 μgTTF·g-1·h-1，葉片可溶性蛋白含量由8.93 mg·g-1降低到8.22 mg·g-1；幼苗葉片細胞膜透性由0.74%增加到0.79%、丙二醛含量由1.40 μmol·g-1增加到2.12 μmol·g-1和脯氨酸含量由21.73 μg·g-1增加到35.81 μg·g-1，不同處理間差異顯著(P<0.05)(表2)。

當鹽分組成為A4的50 mmol·L-1時，“隴油6號”種子的發(fā)芽率為22.67%、幼苗根系活力為85.58 μgTTF·g-1·h-1、葉片可溶性蛋白含量為7.25 mg·g-1、幼苗葉片細胞膜透性為0.84%、丙二醛含量為2.90 μmol·g-1和脯氨酸含量為41.75 μg·g-1，分別是鹽分組成為A1的50 mmol·L-1時的23.61%、90.50%、88.20%、106.33%、136.79%和116.59%，這表明堿性鹽摩爾比例增加明顯影響各脅變指標的變化(表2)。

2.2協(xié)迫因素與協(xié)變指標間的相關(guān)性分析 pH值和CO32-與發(fā)芽率、細胞膜透性、丙二醛、根系活力、脯氨酸以及可溶性蛋白6項協(xié)變指標的相關(guān)系數(shù)均達到極顯著水平(P<0.01)。從總體來看，CO32-最高，其次是pH值；在6項協(xié)變指標中，只有根系活力和脯氨酸含量分別與pH值和鹽度的相關(guān)系數(shù)最高，其余各因素的最大相關(guān)因素均為CO32-，可見堿性鹽對協(xié)變指標具有決定性作用。在各脅迫因素中，HCO3-除與脯氨酸含量具有顯著相關(guān)性外(P<0.05)，與其它各指標的相關(guān)系數(shù)都很低，而SO42-與各協(xié)變指標均無顯著相關(guān)性，因此HCO3-和SO42-的致脅變作用可以忽略；Cl-除與發(fā)芽率無顯著相關(guān)(P>0.05)外，與丙二醛具有極顯著相關(guān)(P<0.01)，與葉片細胞膜透性、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量和根系活力協(xié)變指標呈顯著相關(guān)(P<0.05)，所以Cl-的脅迫作用不可忽略。本試驗中，鹽度和Na+完全正相關(guān)(r=1)，鹽度和Na+除與根系活力相關(guān)性較低外，與發(fā)芽率具有顯著相關(guān)(P<0.05)，與葉片細胞膜透性、丙二醛、脯氨酸和可溶性蛋白含量均達到極顯著相關(guān)(P<0.01)，鹽度和Na+與各脅變指標的相關(guān)系數(shù)也一致，所以Na+的脅迫作用完全可由鹽度代表(表3)。

表2 不同鹽分組合的處理液和不同濃度的鹽處理液對脅變指標的影響Table 2 Effect of strain index on salt treatment with concentration and different concentrations of salt treatment

表3 脅迫作用因素與脅變指標間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation coefficients between stress factors and strain indices

2.3脅迫因素與6項脅變指標間的多元回歸分析 “隴油6號”種子發(fā)芽率與CO32-、Cl-、pH和鹽度4因素間回歸方程的全相關(guān)系數(shù)的平方R2為0.944 5，這表明4因素與種子發(fā)芽率間具有高度線性相關(guān)性。其它脅變指標的R2在0.873 3～0.959 4，分析結(jié)果均可證明，用CO32-、pH值、鹽度和Cl-即可有效代表復合鹽堿脅迫作用的各種因素。比較各脅迫因素的標準回歸系數(shù)可知，對種子發(fā)芽率協(xié)變指標來說，各脅迫因素的重要性依次為 CO32->Cl->pH值>鹽度，其中CO32-為決定性的主導因素，而鹽度的作用較小，若去掉鹽度進行三元回歸分析得R2=0.942 3與四元回歸效果基本一致。油菜葉片細胞膜透性四元回歸R2為0.959 4，鹽度為主要因素，而Cl-為最次要因素，所以將其去掉后進行三元回歸分析得R2=0.936 6，與四元回歸的效果基本一致，這證明了Cl-對細胞膜透性的影響較小。丙二醛含量四元回歸R2為0.913 8;CO32-、Cl-、pH值和鹽度4脅迫因素對MDA含量有同等重要的作用。根系活力與4脅迫因素R2為0.873 3，這表明4脅迫因素與根系活力間具有一定的線性相關(guān)性，比較各因素的標準回歸系數(shù)可知，對根系活力脅變指標來說，各因素的重要性依次為pH值>Cl->CO32->鹽度，其中pH值為決定性的主導因素，而鹽度的作用較小，若去掉鹽度進行三元回歸分析得R2=0.871 7，與四元回歸效果基本一致。脯氨酸含量四元回歸的R2為0.937 9，鹽度為脯氨酸含量的主要脅迫因素，其次是CO32-，而Cl-和pH值的作用較小，若去掉Cl-或pH值進行三元回歸分析，其回歸分析R2分別為0.936 9和0.937 2，這進一步證明了兩者對脯氨酸含量影響較小?？扇苄缘鞍缀颗c4因素間具有高度線性相關(guān)性，各脅迫因素對可溶性蛋白含量的重要性依次為CO32-、鹽度、Cl-和pH值，其中CO32-是決定性主導因素，而pH值的作用很小，去掉pH值后再進行三元回歸分析的結(jié)果為R2=0.934 4，與四元回歸分析的結(jié)果基本一致。由脅迫因素與脅變指標間的多元回歸分析可得出，影響脅變指標的主要脅迫因素是CO32-、pH值和鹽度(表4)。

表4 脅變指標與脅迫因素間的多元回歸分析Table 4 Multiple regression analysis between strain indexs and stress factors

3 討論與結(jié)論

本試驗依據(jù)甘肅河西地區(qū)鹽堿地的組成特點[6]以及白菜型冬油菜的耐受能力，將NaCl、NaHCO3、Na2SO4和Na2CO3按不同摩爾比混合，模擬出20種低鹽度、高pH鹽堿生態(tài)條件，其鹽度覆蓋從10～50 mmol·L-1，pH值從8.50～10.24。一般中性鹽NaCl的主要脅迫因子Na+可造成植物細胞水勢下降的滲透效應(yīng)以及以Na+為主的離子效應(yīng)[8]，而堿性鹽Na2CO3的脅迫作用則需在前者的基礎(chǔ)上加上高pH[9-10,12]。分析20種鹽堿混合條件中的脅迫因素發(fā)現(xiàn)，pH值和CO32-與6項協(xié)變指標均達到極顯著相關(guān)(P<0.01)，鹽度與Na+完全正相關(guān)，兩者與各脅變指標的相關(guān)系數(shù)也一致，所以Na+完全可由鹽度代替。Cl-與各脅變指標間具有極高的相關(guān)性，而HCO3-和SO42-與各脅變指標間的相關(guān)性很低，其致脅變作用可以忽略。試驗結(jié)果表明，高鹽和高堿的共同脅迫作用遠大于單純的高鹽或高堿脅迫，表明鹽度和堿度間具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，應(yīng)將堿性鹽脅迫稱為堿脅迫，中性鹽脅迫稱為鹽脅迫，在生產(chǎn)中應(yīng)將鹽度和pH值作為評價土壤鹽堿化程度的共同指標。

本研究表明，可用 CO32-、pH值、鹽度以及Cl-4個脅迫因素代表鹽堿混合對冬油菜的所有脅迫作用因素，這一結(jié)果與石德成等[2]的研究結(jié)果基本一致。通過對6項協(xié)變指標的回歸分析發(fā)現(xiàn)，不同脅迫因素對6項協(xié)變指標的決定程度有所不同。發(fā)芽率和可溶性蛋白含量的主要脅迫因素均為CO32-，細胞膜透性和脯氨酸含量的主要脅迫因素均為鹽度，而Cl-的脅變作用很小；根系活力與4個脅迫因素間回歸分析發(fā)現(xiàn)pH值為決定性的主要脅迫因素，而鹽度的作用較??；4個脅迫因素對丙二醛含量具有同等重要的脅變作用。在生產(chǎn)中應(yīng)將pH值、鹽度和CO32-作為冬油菜抗鹽堿能力的測定指標。關(guān)于不同脅迫因素對不同脅變指標的影響程度的差異，可能與植物對脅迫響應(yīng)的生理機制及脅變形成的生理過程有關(guān)，還需進一步試驗研究。

鹽度、pH值、CO32-和Cl-可代表鹽堿混合條件下所有脅迫作用因素。pH值、鹽度和CO32-是鹽堿混合條件對冬油菜“隴油6號”脅迫的主導因素，共同影響著鹽堿地冬油菜“隴油6號”的生長，同時Cl-的脅迫作用也是不可忽略的。

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