劉勇，楊華兵，李梅云，李永平

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/中國煙草育種研究南方中心，玉溪 653100

煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)為馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）。病毒粒體為彎曲線狀，以蚜蟲非持久性傳播為主。1964年Chin首次報道了TVBMV在臺灣的發(fā)生情況[1]，受TVBMV侵染的煙草葉片表現(xiàn)花葉、脈帶（沿葉脈的帶狀綠島）及壞死斑癥狀[1]。稱為脈帶花葉病。1989年-1991年我國主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害普查中，在福建、廣東和山東發(fā)現(xiàn)TVBMV，為偶發(fā)病害[2]。福建省在1987年-1991年的煙草病害調(diào)查中，TVBMV平均檢出率為1.38%[3]。1998年張仲凱等報道了TVBMV在云南的發(fā)生[4]。因為TVBMV在田間引起和馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）相似的癥狀，云南省煙草生產(chǎn)上常將TVBMV與PVY引起的病害統(tǒng)稱為“煙草脈斑病”[5]。因此，TVBMV在我國煙草上的危害在很大程度上被低估[6,7]。

1992年Reddick等首次報道了TVBMV在北美煙草上的發(fā)生，在田納西州采集的70個白肋煙病毒病樣品中，發(fā)現(xiàn)16%的樣品感染TVBMV[8]。1994年Reddick的研究小組和Chang同時分別報道了北美Tennessee分離物[9]和臺灣分離物[7]基因組3’-端核苷酸的序列，從分子水平明確TVBMV為馬鈴薯Y病毒屬的一個確定種。2004年-2006年，Tian等[6]在我國的山東、河南、安徽、云南等地檢測到12個TVBMV分離物，檢出率約占總病毒病樣品數(shù)的30%。劉勇等在云南省煙草主產(chǎn)區(qū)，檢測得到20個TVBMV分離物，并通過測定CP和HC-Pro基因序列，了解云南省煙草上TVBMV的遺傳多樣性。

多年來，病毒病造成的損失居全國煙草侵染性病害的首位。煙草病毒病的種類有20多種，近5年來，云南省煙草主栽品種有云煙85、云煙87、云煙97、K326、紅花大金元、TN86、巴斯瑪1號等。由于TVBMV寄主范圍較廣、蚜蟲傳播效率高、缺少有效的防治藥劑，生產(chǎn)上防治困難[1,2]。選育與種植抗病品種是防治病害的經(jīng)濟有效措施。由于TVBMV在煙草上的危害被低估，且未列入我國煙草品種抗性鑒定的病害名單之中，迄今為止未見我國煙草品種對TVBMV抗性評價報道。本文采用人工接種方法研究了我國20個煙草品種的TVBMV癥狀與抗性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種共20份（表1），由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（中國煙草育種研究南方中心）提供。包括云南省主栽的烤煙品種、新引進的烤煙品種、香料煙和白肋煙品種。在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院研和實驗基地的防蟲大棚內(nèi)進行人工接種抗性鑒定。

表1 供試煙草品種來源和已知病毒病抗病基因型

1.2 病毒株系

TVBMV病毒分離物YN-3，為云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院分離保存。在接種前30 d左右在心葉煙（Nicotiana glutinosa）或枯斑三生煙（N.tobacumvar Samsun NN）上繁殖備用。待接種時用免疫檢測試紙條檢測驗證未被其他病毒污染。

1.3 試驗方法

塑料防蟲大棚內(nèi)進行，時間為2011年7～9月份。按常規(guī)方法漂浮育苗?？緹熎贩N煙苗5～6片葉時，用直徑20 cm一次性塑料花盆移栽。每份材料19株，重復(fù)3次。成活后，采用高壓噴槍摩擦接種。方法為：采集TVBMV新鮮病葉，在無菌研缽中，用接種緩沖液（0.01 mol/L pH 7.0 磷酸鹽緩沖液＋0.4% 亞硫酸鈉）研磨，雙層紗布過濾后，調(diào)整接種液的濃度為1∶100（重量體積比）。接種前在病毒汁液中加入1%200目化學(xué)純二氧化硅，高壓噴槍噴射壓力設(shè)定為1kg/cm2。噴口距接種物約20 cm，每株噴射接種時間約為0.5 s。接種后立即用噴壺噴少量井水，提高接種效率。

1.4 病情調(diào)查

煙苗接種后，每7 d左右調(diào)查發(fā)病情況，連續(xù)調(diào)查3～4次，或調(diào)查至最感病品種病情指數(shù)達到80左右。病害嚴重度分級參照國家標準《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》（GB/T 23222-2008）[15]，根據(jù)TVBMV癥狀稍加修改。0級：全株無??；1級：心葉脈明或輕微花葉；3級：上部≤1/3葉片花葉、脈帶或壞死線紋；5級：1/3～1/2葉片花葉、脈帶或壞死線紋；7級：1/2～2/3葉片花葉，或脈帶、壞死線紋；9級：2/3以上葉片花葉，脈帶或壞死線紋。逐株調(diào)查發(fā)病情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理與抗性評價

根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，分別計算發(fā)病率、病情指數(shù)。參照國家標準《煙草品種抗病性鑒定》（GB/T 23224-2008）[16]，以感病品種發(fā)病最先達到感?。ú∏橹笖?shù)不低于60）的調(diào)查數(shù)據(jù)為依據(jù)，進行品種抗病性評價。品種抗病性評價標準如下：高抗（HR）：病情指數(shù)為0；抗?。≧）：病情指數(shù)為0.1～20；中抗（MR）:病情指數(shù)為20.1～40；中感（MS）: 病情指數(shù)為40.1～60；感病（S）: 病情指數(shù)為60.1～80；高感（HS）: 病情指數(shù)為80.1～100。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草品種接種TVBMV的癥狀特征

試驗期間塑料大棚白天平均氣溫26℃，夜晚平均氣溫19℃。高壓噴槍摩擦接種TVBMV YN-3分離物新鮮病葉汁液100倍稀釋液， MSK326接種后7d表現(xiàn)癥狀，接種后14d發(fā)病率高達87%。TVBMV的癥狀因品種的病毒病抗病基因型而異。VaVa/nn基因型（感PVY感TMV）品種的心葉及鄰近2片幼葉表現(xiàn)脈明或脈帶花葉癥狀（沿葉脈的帶狀綠島）；其他幼葉表現(xiàn)典型的脈帶花葉癥狀。vava/nn基因型（抗PVY感TMV）品種NC55，TN86和TN90的心葉及鄰近2片幼葉無癥狀，稍大幼葉表現(xiàn)為葉尖部深綠色斑塊、葉基部褪綠黃化，脈帶癥狀和花葉癥狀不明顯；其他葉片表現(xiàn)深綠色斑塊。推測va基因位點可抑制幼嫩葉片表現(xiàn)TVBMV癥狀。vava/Nn基因型（雙抗PVY和TMV）品種NC102，幼葉還表現(xiàn)點、線狀白色壞死，類似蝕紋癥狀，但壞死線較蝕紋寬。推測該癥狀是TVBMV與N基因、va基因位點互作的結(jié)果。香料煙巴斯瑪1號的癥狀為：心葉及最小2片幼葉無癥狀，其他葉片表現(xiàn)較輕的斑駁，幼葉葉尖部分深綠色斑塊，脈帶花葉的癥狀不明顯?？傊?，從苗期接種至開花，供試煙草品種葉片均未見皰斑、葉片畸形、鼠尾、花葉灼班等TMV和CMV的典型癥狀，也未見葉脈褐色壞死等PVY壞死株系的典型癥狀。脈帶花葉和深綠色斑塊是TVBMV區(qū)別于TMV、CMV和PVY壞死株系的典型癥狀特征。TVBMV的癥狀相對TMV和PVY較輕，造成的產(chǎn)量損失相對較小。

2.2 煙草品種TVBMV抗性評價

除香料煙巴斯瑪1號外，煙草品種對TVBMV的抗性與va位點相關(guān)。vava基因型品種接種后7d和14d的發(fā)病率和病情指數(shù)明顯低于VaVa基因型品種（表2）。接種后21d和28d的發(fā)病率和病情指數(shù)兩種基因型之間的差異縮小。表明攜帶va位點抗PVY的品種，表現(xiàn)低抗TVBMV。VaVa基因型品種的發(fā)病快，接種后14d，6個品種的病情指數(shù)達到60。其中主栽品種MSK326在接種后14d的病情指數(shù)為68.1，在供試品種中處于較高水平。以MSK326作為感病對照，按照國家標準《煙草品種抗病性鑒定》評價，供試品種對TVBMV的抗性為：巴斯瑪1號、TN86-8、NC55和TN90為中抗； NC102、MS云煙87、云煙85、NC297、云煙201、紅花大金元、云煙97、云煙203和云煙317為中感；V2、云煙202、云煙100、G-28、MSK326、K346和RGH51為感病。接種后21d和接種后28d調(diào)查，供試品種的病情指數(shù)都達到70以上，表明供試品種對TVBMV表現(xiàn)為耐病或感病。香料煙巴斯瑪1號由于生長比烤煙迅速，接種時的葉片數(shù)較多，根據(jù)病害分級調(diào)查的病級相對較低，病情指數(shù)相對較低。

表2 煙草品種TVBMV抗性評價

續(xù)表2

3 結(jié)論與討論

本研究在防蟲塑料大棚內(nèi),通過高壓噴槍接種煙苗,觀察了煙草品種的TVBMV的癥狀。TVBMV的癥狀因品種的基因型va位點與N基因而異。常見的VaVa/nn基因型（感PVY感TMV）品種表現(xiàn)為：心葉及鄰近2片幼葉脈明或脈帶花葉；其他幼葉表現(xiàn)典型的脈帶花葉。vava/nn基因型（抗PVY感TMV）品種表現(xiàn)為心葉及鄰近2片幼葉無癥狀，稍大幼葉表現(xiàn)為葉尖部深綠色斑塊、葉基部褪綠黃化，脈帶癥狀和花葉癥狀不明顯；其他葉片表現(xiàn)深綠色斑塊。va基因位點可抑制幼嫩葉片表現(xiàn)TVBMV癥狀。

TVBMV 田間樣品（室內(nèi)檢測TVBMV陽性、TMV/CMV/PVY/TEV陰性的樣品）癥狀（云煙85品種）為：脈帶花葉；葉尖部深綠色、葉基部細小壞死點線。YN-3分離物在大棚中接種未見葉基部細小壞死點線癥狀。田間癥狀與本文接種癥狀的差異可能由溫度等環(huán)境條件引起。TVBMV在煙株現(xiàn)蕾后明顯隱癥，一直到開花期，未見明顯的葉片畸形和壞死，造成的產(chǎn)量損失比TMV和PVY小。本文觀察的癥狀是一個株系（YN-3）在大棚內(nèi)人工接種的結(jié)果。

根據(jù)接種后每隔7d調(diào)查一次，連續(xù)4次調(diào)查的平均病情指數(shù)，vava基因型品種低抗TVBMV，VaVa基因型品種都不抗TVBMV。TVBMV和PVY同屬，推測va位點低抗TVBMV的機理類似于va位點抗PVY。品種間的抗性在接種后14d內(nèi)差異明顯，而接種后21d品種間的抗性差異縮小。表明va位點只能減緩TVBMV的癥狀發(fā)展。

國內(nèi)未見煙草品種對TVBMV抗性評價的文獻報道。本文嘗試采用國家標準[16]評價煙草品種的抗性。以接種后發(fā)病快的主栽品種K326為感病對照，以K326首次達到感?。ú∏橹笖?shù)達到60.1）時調(diào)查的病情指數(shù)對19個煙草品種進行了抗性評價。結(jié)果表明，vava基因型的品種TN86等中抗TVBMV，VaVa基因型品種云煙85等中感或感病。但隨后間隔7d和14d調(diào)查供試品種的病情指數(shù)都達到70以上，表明供試品種對TVBMV表現(xiàn)為耐病或感病，缺乏持久的抗性。國家標準0～9級病級劃分[15]和6檔抗性[16]劃分，有利于品種抗性的精細評價，但同時存在抗性評價結(jié)果年度間容易波動的問題。有必要研究綜合病情發(fā)展的指標來評價煙草品種抗性。

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