秦娟娟，路志勇，焦章平，朱曉君，王穎希，唐暉

（1.山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，山西太原 030001；2.北京市公安局刑偵總隊，北京 100192）

改良TRIzol法同步提取血液RNA和DNA

秦娟娟1，路志勇2，焦章平2，朱曉君2，王穎希1，唐暉2

（1.山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學系，山西太原 030001；2.北京市公安局刑偵總隊，北京 100192）

目的建立一種應用TRIzol試劑針對同一生物檢材在提取總RNA的同時又能提取DNA的新方法。方法使用傳統(tǒng)TRIzol法將含有總RNA的水相移除，調(diào)節(jié)中間層和有機相的pH值，乙醇沉淀DNA，運用DNA IQTMsystem試劑盒純化DNA。檢測DNA純度和質(zhì)量濃度，并以之為模板進行PCR-STR分型。與傳統(tǒng)TRIzol法提取的基因組DNA進行比較。結(jié)果改良TRIzol法提取的基因組DNA較傳統(tǒng)TRIzol法提取的基因組DNA純度和質(zhì)量濃度高，擴增后STR分型良好。結(jié)論改良TRIzol法可靠易行，能夠?qū)崿F(xiàn)同一樣本同時提取RNA和DNA的目的，可以滿足法庭科學個體識別和親緣鑒定的要求。

法醫(yī)遺傳學；提取法；TRIzol法；血液

TRIzol試劑是當前從細胞或組織中提取總RNA的常用試劑，最大的特點就是可同時分離一個樣品中的RNA、DNA和蛋白質(zhì)。使用TRIzol法同時提取法醫(yī)檢材中的RNA和DNA進行個體識別和體液鑒別，已經(jīng)成為目前法醫(yī)學實驗室研究的熱點之一。但是，在提取總RNA之后，僅依照TRIzol試劑盒說明書的操作步驟，利用剩余的中間層和有機相提取DNA，操作時間長（約為3h），且其中的苯酚、蛋白質(zhì)污染會影響后續(xù)實驗的效果，不利于該法的推廣。本研究對TRIzol法加以改進，使之在同一檢材中提取總RNA的同時又能制備較高純度和質(zhì)量濃度基因組DNA，且經(jīng)該法處理后的樣本可以用現(xiàn)有常規(guī)實驗室方法進行后續(xù)實驗，同時進行手工與自動化提取。

1 材料與方法

1.1 樣本

收集健康成人血液200μL，分別取10μL涂抹于20個FTA卡上陰干后，室溫儲存。10份用于傳統(tǒng)TRIzol法，10份用于改良TRIzol法。

1.2 儀器與試劑

小型臺式離心機、大型冷凍離心機、NanoDrop? ND-1000微量紫外可見分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)、9700型擴增儀、3130XL遺傳分析儀（美國AB公司）。

TRIzol?試劑盒、SuperScriptTMⅢRT/Platinum? Taq DNA Polymerase MIX試劑盒（美國Invitrogen生命技術公司），DNA IQTMsystem（美國Promega公司），IdentifilerTM試劑盒（美國AB公司），枸櫞酸鈉，無水乙醇，氯仿，氫氧化鈉（NaOH）。

1.3 方法

1.3.1 RNA和DNA的提取

RNA和DNA的提取分別采用傳統(tǒng)TRIzol法和改良TRIzol法進行。

傳統(tǒng)TRIzol法：剪取1cm2FTA血卡放入1.5mL的微量離心管中，加入1mL TRIzol，振蕩5min，然后加入200μL氯仿劇烈振蕩15s，放置3min后，4℃下12000×g離心15min，吸取上層水相液體按照TRIzol說明書的操作步驟提取RNA。在去除上層水相后的中間層和有機相中加入300 μL冷無水乙醇混勻，室溫放置3min，4℃下，2000×g離心5min，沉淀DNA。然后用0.1 mol/L枸櫞酸鈉溶液（含10%乙醇）1 mL洗滌DNA沉淀，室溫放置30 min，重復3次，最后用1.5mL 75%乙醇溶液洗滌，室溫放置20min，重復3次，空氣中干燥DNA沉淀約15 min，用8 mmol/L NaOH溶液40μL溶解DNA沉淀，用10μL TE調(diào)節(jié)DNA沉淀至pH約為8.4，4℃下保存?zhèn)錂z。

改良TRIzol法：RNA的提取同傳統(tǒng)TRIzol法。在去除水相后的中間層和有機相中加入5 mol/L的NaOH 10μL立即混勻，室溫放置3min后加入300μL冷無水乙醇混勻，室溫放置3min，室溫下，12 000×g，離心5min，沉淀DNA，加入200 μL裂解緩沖液后采用DNA IQTMsystem試劑盒進行純化。

分別取以上方法提取的DNA 1 μL，使用Nano-Drop?ND-1000微量紫外可見分光光度計測定DNA 的D260和D280，根據(jù)D260與D280的比值確定提取DNA的純度。

每份樣本的純度和質(zhì)量濃度均重復測量3次，取平均值。用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對兩種方法提取的DNA純度和質(zhì)量濃度分別進行比較。

1.3.2 擴增和檢測

以上提取的RNA按照SuperScriptTMⅢRT/Platinum?Taq DNA Polymerase MIX試劑盒說明，使用文獻[1]中的引物序列擴增管家基因18S、GAPDH （TAMRA熒光標記）和外周血特異性遺傳標記SPTB （FAM熒光標記）。

提取的DNA均用IdentifilerTM試劑盒進行擴增，3130XL遺傳分析儀檢測。GeneMapper ID v3.2軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

兩種方法提取的DNA純度和質(zhì)量濃度，差異均有統(tǒng)計學意義（表1，P＜0.05）。傳統(tǒng)TRIzol法與改良TRIzol法提取DNA的STR分型圖譜分別見圖1～2。采用以上方法提取的RNA，經(jīng)管家基因18S、GAPDH和外周血特異性遺傳標記SPTB檢測，均成功得到相應的目的產(chǎn)物。

表1 兩種方法提取DNA的純度和質(zhì)量濃度比較（n=10，±s）

表1 兩種方法提取DNA的純度和質(zhì)量濃度比較（n=10，±s）

方法D260/D280質(zhì)量濃度/（ng/μL）傳統(tǒng)TRIzol1.301±0.0650.618±0.209改良TRIzol1.470±0.0651.498±0.297

圖1 傳統(tǒng)TRIzol法提取DNA的STR分型

圖2 改良TRIzol法提取DNA的STR分型

3 討論

DNA在法醫(yī)學個體識別和親子鑒定中發(fā)揮著重要作用，但DNA只具有種屬特異性而沒有組織特異性，不能判斷法醫(yī)檢材的組織來源，而mRNA和microRNA具有組織特異性[2]，成為目前法醫(yī)學體液鑒別的熱點。TRIzol試劑內(nèi)含苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放核酸酶，并且能夠同時分離樣品的RNA和DNA。然而，目前常用的TRIzol法只對總RNA的分離效果較好，提取的DNA純度和質(zhì)量濃度并不理想。本研究采用了一種便捷、高效的改良TRIzol法提取基因組DNA，充分利用實驗材料，盡可能多地保留檢材中的遺傳信息，從而可以滿足利用少量生物檢材同時確定檢材類型和STR分型，具有實際應用價值。

TRIzol法提取RNA和DNA的原理是利用RNA 和DNA的等電點不同，RNA為2～2.5，DNA為4～4.5，因此RNA和DNA的溶解度受pH值的調(diào)節(jié)。在酸性酚中抽提時，水相回收RNA，然后用乙醇對處于酚相和酚相-水相界面的DNA進行沉淀，再用8 mmol/L NaOH進行溶解。根據(jù)堿性環(huán)境中DNA水溶性高的特點，改良TRIzol法提前將分離水相后的剩余溶液pH值調(diào)至堿性，以促進DNA在含乙醇的有機溶劑中充分沉淀。由于DNA在pH值為5～9的環(huán)境中穩(wěn)定，在pH＞7.8的有機溶液中處于析出狀態(tài)，當pH＞12會引起雙鏈之間的氫鍵斷裂，因此剩余溶液pH值不宜過高。本法在剩余液中加入5 mol/L的NaOH 10 μL調(diào)節(jié)其pH≈8，使剩余液的酸堿度達到最佳沉淀條件。此外，Na+的加入也會促進DNA的沉淀，而鈉鹽在后續(xù)的步驟中洗脫。

DNA IQTM法是目前法醫(yī)學實驗室最廣泛使用的DNA提取方法，與其他提取方法比較，提取的DNA純度較好且得率最高[3]。改良TRIzol法將DNA IQTM法和傳統(tǒng)TRIzol法相結(jié)合，所提取DNA的純度和質(zhì)量濃度均高于傳統(tǒng)TRIzol法。NaOH溶液的加入使提取的DNA易溶于TE緩沖液或洗脫緩沖液中，可以在-20℃長期保存，免去了傳統(tǒng)TRIzol法使用8mmol/L NaOH溶解后又要加入TE緩沖液或HEPES緩沖液調(diào)節(jié)pH值至8.4才可進行PCR，或調(diào)節(jié)pH值至7～8并加入1mmol/L EDTA溶液才可以長期保存的繁瑣步驟。

在法庭科學中，提取人類基因組DNA的主要目的是用于STR遺傳標記的分型檢測，達到個體識別或親子鑒定的目的，而通過對現(xiàn)場檢材RNA的分析來進行組織來源的判定，對案件的性質(zhì)判定具有重要的價值，能夠使法醫(yī)物證檢材在法庭中更具有說服力。近年來，Bowden等[4]使用DNA IQTMsystem和Mini RNA Isolation KitTMⅡ兩個試劑盒相結(jié)合的方法從同一份樣本中成功分離RNA和DNA，為法醫(yī)學實驗室通過應用少量檢材來同時確定檢材類型和STR分型的廣泛應用提供了基礎。改良TRIzol法作為一種可以同時滿足手工與自動化提取同一檢材中總RNA和DNA的新方法，可以得到良好的RNA和DNA的STR分型結(jié)果，并且能大大縮短操作時間。

本研究所建立的方法操作簡便、快速有效，且與現(xiàn)有常用DNA提取平臺有機結(jié)合，較傳統(tǒng)TRIzol法更適用于實際案件檢驗，為法醫(yī)學實驗室充分利用少量檢材來同時確定檢材類型和STR分型提供了一種可靠易行的實驗方法。

[1]Haas C，Klesser B，Maake C，et al.mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR[J].Forensic Sci Int Genet，2009，3（2）：80-88.

[2]Bauer M.RNA in forensic science[J].Forensic Sci Int Genet，2007，1（1）：69-74.

[3]暢晶晶，張素華，李莉.全血中DNA 6種提取方法的比較[J].法醫(yī)學雜志，2009，25（2）：109-111，114.

[4]Bowden A，F(xiàn)leming R，Harbison S.A method for DNA and RNA co-extraction for use on forensic samples using the Promega DNA IQTMsystem[J].Forensic Sci Int Genet，2011，5（1）：64-68.

Modified TRIzol Method for RNA and DNA Co-extraction from Blood

QIN Juan-juan1,LU Zhi-yong2,JIAO Zhang-ping2,ZHU Xiao-jun2,WANG Ying-xi1,TANG Hui2
（1.Department of Forensic Medicine,School of Basic Medicine,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001, China;2.Criminal Investigation Team,Beijing Public Security Bureau,Beijing 100192,China）

ObjectiveTo establish a new method for RNA and DNA co-extraction from the same sample by TRIzol reagent.MethodsAfter the aqueous phase which contained total RNA was removed by traditional TRIzol method,the values of pH of the interphase phase and organic phase were adjusted. The DNA was precipitated with ethanol and purified with DNA IQTMsystem.The purified DNA was measured in quality and quantity.As the template,it was amplified and typed by PCR-STR.The data was compared with that extracted by traditional TRIzol method.ResultsThe DNA extracted by this modified method showed a better result of quality and quantity than that by traditional TRIzol method and a good STR typing.ConclusionThe modified TRIzol method is advisable and reliable to simultaneously extract both DNA and RNA from the same sample.It could be used for individual identification and paternity testing to satisfy the need of forensic science.

forensic genetics;extraction;TRIzol method;blood

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.014

1004-5619（2013）03-0209-03

2012-07-13）

（本文編輯：李成濤）

北京市科技計劃資助項目（Z111100056811024）

秦娟娟（1987—），女，山西臨汾人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)DNA研究；E-mail：594570279@qq.com

唐暉，女，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA檢驗和研究；E-mail：huihuitangno1@163.com