穆豪放，徐達(dá)，劉濱，黃艷清，王麗娜，張博，陳峰

（1.北京華大方瑞司法物證鑒定中心，北京 101300；2.韶關(guān)市公安局刑警支隊(duì)，廣東韶關(guān) 512000；3.北京市朝陽(yáng)區(qū)公安司法鑒定中心，北京 100024；4.南京醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系，江蘇南京 210029）

227例疑似常染色體STR基因座突變的回顧分析

穆豪放1，徐達(dá)2，劉濱3，黃艷清1，王麗娜1，張博1，陳峰4

（1.北京華大方瑞司法物證鑒定中心，北京 101300；2.韶關(guān)市公安局刑警支隊(duì)，廣東韶關(guān) 512000；3.北京市朝陽(yáng)區(qū)公安司法鑒定中心，北京 100024；4.南京醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)系，江蘇南京 210029）

目的對(duì)疑似常染色體STR基因座突變案例進(jìn)行研究分析。方法從本鑒定中心親子鑒定案例中整理出疑似突變案例227例進(jìn)行分析，篩選等位基因突變案例，統(tǒng)計(jì)各STR基因座的突變數(shù)，計(jì)算疑似突變案例的CPI值，分析突變的規(guī)律及其特點(diǎn)。結(jié)果227例疑似突變案例中有3個(gè)案例為排除親權(quán)關(guān)系，其余案例共在18個(gè)STR基因座位上出現(xiàn)228次突變，每個(gè)突變案例的突變基因座數(shù)目為1～2個(gè)，最多突變步數(shù)為四步。3例排除親權(quán)關(guān)系案例計(jì)算擴(kuò)增20A試劑盒后的CPI值都<104，標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體聯(lián)合使用20A和10G試劑盒時(shí)CPI值全部超過(guò)了104，二聯(lián)體單親鑒定聯(lián)合使用20A和10G試劑盒時(shí)有99.45%的CPI值超過(guò)104。結(jié)論STR基因座等位基因突變現(xiàn)象較為常見，當(dāng)出現(xiàn)疑似突變案例時(shí)應(yīng)增加STR基因座的檢測(cè)數(shù)量，或補(bǔ)充樣本為完整三聯(lián)體，以最大程度地降低誤判風(fēng)險(xiǎn)。

法醫(yī)遺傳學(xué)；突變；染色體畸變；短串聯(lián)重復(fù)序列；親子鑒定

短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）又稱微衛(wèi)星DNA，是目前法醫(yī)物證中應(yīng)用最廣泛的長(zhǎng)度多態(tài)性遺傳標(biāo)記，雖然具有高度多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性，但也存在遺傳突變的情況。據(jù)報(bào)道[1]，STR基因座發(fā)生突變的概率平均約為2.1×10-3。目前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的PowerPlex?16試劑盒和IdentifilerTM試劑盒能夠基本滿足個(gè)體識(shí)別和標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體親子鑒定的需要，但在遇到1個(gè)或2個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律疑似突變的案件時(shí)，則需檢測(cè)更多的STR基因座從而判斷是否發(fā)生了突變。本鑒定中心收集疑似突變案例227例，聯(lián)合使用GoldeneyeTMDNA身份鑒定系統(tǒng)20A試劑盒［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司，簡(jiǎn)稱20A試劑盒］和STRtyper-10F/G試劑盒（珠?？频巧锕こ逃邢薰?，簡(jiǎn)稱10G試劑盒）用于疑似突變案件的檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1 材料與方法

1.1 樣本

本研究統(tǒng)計(jì)的227例疑似突變樣本均來(lái)自于北京華大方瑞司法物證鑒定中心2010年8月至2012年3月鑒定的案件。疑似突變樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)為：使用20A試劑盒擴(kuò)增后出現(xiàn)1個(gè)或2個(gè)基因座不符合孟德爾遺傳定律。

1.2 STR檢測(cè)

[2]采用Chelex-100法提取模板DNA，用20A試劑盒擴(kuò)增檢測(cè)19個(gè)STR基因座，當(dāng)出現(xiàn)1個(gè)或2個(gè)矛盾基因座時(shí)用10G試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件參照試劑盒說(shuō)明書，兩個(gè)試劑盒檢測(cè)的基因座有：D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338、FGA、D18S1364、D13S325、D2S1772、D11S2368、D22-GATA198B05、D8S1132、D7S3048共計(jì)26個(gè)STR基因座及性別位點(diǎn)Amelogenin。為了避免沉默基因的影響，當(dāng)疑似突變基因座為純合子時(shí)，使用PowerPlex?16試劑盒（美國(guó)Promega公司）和IdentifilerTM、SinofilerTM試劑盒（美國(guó)AB公司）進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增驗(yàn)證[3]，驗(yàn)證數(shù)據(jù)無(wú)誤后方可確認(rèn)疑似突變。

擴(kuò)增產(chǎn)物用3130遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，由GeneMapper v3.2軟件自動(dòng)分析基因型。

1.3 突變判定

根據(jù)北方漢族人群的相關(guān)基因頻率資料[4]計(jì)算親權(quán)指數(shù)（PI）和累積親權(quán)指數(shù)（CPI），符合遺傳定律的基因座根據(jù)通用的方法進(jìn)行計(jì)算；不符合遺傳定律的基因座則按照司法部頒布的規(guī)范方法[5]計(jì)算，突變率μ則采用平均突變率0.002計(jì)算。當(dāng)計(jì)算得CPI≥104，有1個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律且突變步長(zhǎng)為1個(gè)核心序列時(shí)，則支持親權(quán)關(guān)系即確認(rèn)疑似突變確為突變；突變步長(zhǎng)≥2個(gè)核心序列或2個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律時(shí)，需要增加檢測(cè)Investigator Argus X-12試劑盒（德國(guó)QIAGEN公司）、Y-filer試劑盒（美國(guó)AB公司）、AGCU 21+1 STR試劑盒（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)公司）等進(jìn)行驗(yàn)證，當(dāng)沒(méi)有再增加其他不符合基因座且CPI≥104，則支持親權(quán)關(guān)系確認(rèn)為突變。

2 結(jié)果

2.1 排除突變

227例疑似突變案例中二聯(lián)體鑒定案例有185例，標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體鑒定案例有42例。227個(gè)案例中有3例最終排除了突變的可能，這3個(gè)案例都為二聯(lián)體鑒定，其中2例為父子鑒定，1例是母子鑒定。只擴(kuò)增20A試劑盒時(shí)，這3例疑似突變案例都發(fā)現(xiàn)只有1個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律，并且除了1例突變步長(zhǎng)是兩步外，其余2例都是一步。當(dāng)加做10G試劑盒后發(fā)現(xiàn)，3例疑似突變案例又都增加了2個(gè)基因座不符合遺傳規(guī)律，經(jīng)計(jì)算CPI值<104，符合排除親權(quán)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)。此外，為了保證鑒定結(jié)論的準(zhǔn)確無(wú)誤，還加做Investigator Argus X-12、Y-filer、AGCU 21+1 STR等試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增加了更多的排除基因座，此3例最終排除了突變的可能性。

2.2 突變觀察

227例中，有224例發(fā)生突變，且在18個(gè)STR基因座上觀察到228次突變，18個(gè)STR基因座發(fā)生突變的頻次和突變率見表1。有4例（1.79%）出現(xiàn)2個(gè)基因座突變，其余220例（98.21%）均出現(xiàn)1個(gè)基因座突變。有219例（97.77%）為一步突變，4例（1.79%）為兩步突變，1例（0.45%）為四步突變。標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體突變來(lái)源中父子突變有27例（64.29%），母子突變有8例（19.05%），父母未定突變有7例（16.67%）。

表1 中國(guó)北方漢族18個(gè)STR基因座的突變頻次和突變率（n=9049）

2.3 疑似突變案例CPI值

227例疑似突變案例按照文獻(xiàn)[3]計(jì)算突變基因座的PI值和CPI值，CPI值的改變情況見表2。其中有1例二聯(lián)體鑒定檢測(cè)了20A和10G試劑盒后計(jì)算CPI值<104，又加做AGCU 21+1 STR試劑盒，經(jīng)計(jì)算，CPI值≥104，最終確認(rèn)為突變。

表2 不同試劑盒在二聯(lián)體和三聯(lián)體鑒定中疑似突變案例的CPI值統(tǒng)計(jì)［例（%）］

3 討論

現(xiàn)有資料[3，6-8]表明，STR突變是DNA復(fù)制滑動(dòng)的結(jié)果，即在DNA合成過(guò)程中，聚合酶會(huì)從模板上脫離，新合成的DNA鏈也與模板鏈發(fā)生暫時(shí)分離，并可能發(fā)生鏈的滑動(dòng)，再次互補(bǔ)結(jié)合時(shí)形成錯(cuò)配的突出環(huán)，從而使新合成的DNA鏈增加或減少一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位即一步突變或幾步突變。本研究發(fā)現(xiàn)，STR突變多為一步突變（97.77%），一般來(lái)說(shuō)，一步突變占突變總數(shù)的90%[7]。根據(jù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體突變案例的觀察，父子突變與母子突變比值為3.375（27例/8例），與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的男性突變率是女性突變率3.5倍的結(jié)論相接近。說(shuō)明突變的發(fā)生具有性別傾向，即女性STR基因座在遺傳過(guò)程中更穩(wěn)定，而男性STR基因座在遺傳過(guò)程中更易發(fā)生突變。

綜合以往報(bào)道[3，10]并通過(guò)對(duì)表1的觀察發(fā)現(xiàn)，不同的STR基因座其突變率也不相同，擴(kuò)增片段較大的STR基因座（如vWA、Penta E、D12S391、FGA）更容易發(fā)生突變，這可能是因?yàn)镾TR基因座突變率與其多態(tài)性的高低有關(guān)，重復(fù)單位數(shù)目多的基因座長(zhǎng)度較長(zhǎng)，其多態(tài)性一般較高，突變率也較高[7]。

用STR基因座進(jìn)行親權(quán)鑒定時(shí)，對(duì)符合孟德爾遺傳定律的，需計(jì)算各基因座PI值和CPI值，看能否達(dá)到認(rèn)定的標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)有1或2個(gè)STR基因座不符合孟德爾遺傳定律時(shí)，則需要仔細(xì)分析，尤其是二聯(lián)體鑒定，疑似突變的案例很可能不是突變而是排除親權(quán)關(guān)系。此類案例在使用20A試劑盒擴(kuò)增后計(jì)算突變基因座的PI值和CPI值，發(fā)現(xiàn)其CPI值遠(yuǎn)小于認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)，提示加擴(kuò)其他試劑盒來(lái)驗(yàn)證。

作出支持親權(quán)關(guān)系結(jié)論時(shí)，CPI值要求多少，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間并沒(méi)有一個(gè)絕對(duì)值。在美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)（AABB）認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室中，對(duì)最低CPI值的要求為102～105[11]，2010年發(fā)布的我國(guó)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦為104[3]，本中心以我國(guó)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為準(zhǔn)。根據(jù)本研究統(tǒng)計(jì)的227例疑似突變案例的CPI值變化情況，單獨(dú)使用20A試劑盒時(shí)，92.86%的案例CPI值≥104，提示20A試劑盒基本能滿足標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體鑒定的需要。而在二聯(lián)體單親鑒定中，單獨(dú)使用20A試劑盒時(shí)則僅有52.43%的案例CPI值≥104，甚至還有7.03%的案例CPI值≤102。該結(jié)論說(shuō)明，單獨(dú)使用20A試劑盒并不能完全滿足二聯(lián)體鑒定的要求，仍需進(jìn)一步增加STR基因座的檢測(cè)數(shù)量（如增加10G試劑盒），或補(bǔ)充樣本為完整三聯(lián)體，以最大程度地降低誤判風(fēng)險(xiǎn)。

?“Amaritudine”（苦澀），見 Cesare Ripa,Iconologia,Roma，1603，p12.

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Mutation of Suspected Autosomal STR Loci:227 Cases Retrospective Analysis

MU Hao-fang1,XU Da2,LIU Bin3,HUANG Yan-qing1,WANG Li-na1,ZHANG Bo1,CHEN Feng4
（1.Center of Forensic Sciences,Beijing Genomics Institute,Beijing 101300,China;2.Criminal Police Branch, Shaoguan Public Security Bureau,Shaoguan 512000,China;3.Forensic Science Identification Center, Chaoyang District Public Security Bureau,Beijing 100024,China;4.Department of Forensic Medicine, Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China）

ObjectiveTo study the suspected autosomal STR loci mutation cases.MethodsA total of 227 suspected autosomal STR loci mutation cases were selected from Center of Forensic Sciences,Beijing Genomics Institute.The allelic mutation cases were screened and the number of mutation of each STR loci was statistically analyzed.The CPI value was calculated in order to study the characteristics and rules of the mutations.ResultsIn the 227 suspected mutation cases,3 cases were excluded paternity,and 228 mutations were observed at 18 STR loci in the rest of the cases.The average number of STR mutation loci was 1-2.The maximum of mutation step was 4.After using 20A amplification kit, the CPI values in 3 non-parentage cases were all less than 104.After using 20A and 10G amplification kits,the CPI values were all larger than 104in all standard parents-child triplet cases and in 99.45%of diad cases.ConclusionThe allelic mutation of STR loci is relatively common in forensic cases.By increasing the number of the required STR loci and supplementing the samples ofthe triplet,the identification errors could be decreased to a great extent when suspected autosomal STR loci mutation occurs.

forensic genetics;mutation;chromosome aberrations;short tandem repeat;paternity testing

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.010

1004-5619（2013）03-0196-03

2012-05-03）

（本文編輯：李成濤）

穆豪放（1981—），男，河北辛集人，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)研究；E-mail：muhf@genomics.org.cn

陳峰，男，博士，教授，主要從事法醫(yī)物證學(xué)教學(xué)及科研工作；E-mail：xjtuchenfeng@gmail.com