高迪，唐新華，黃京璐，郝博，湯大為，李明，羅斌

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510080；2.東源縣公安局，廣東東源 517500）

·論著·

病毒性心肌炎致死者心肌中VCAM-1和caspase-3的表達

高迪1，唐新華2，黃京璐1，郝博1，湯大為1，李明1，羅斌1

（1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510080；2.東源縣公安局，廣東東源 517500）

目的觀察病毒性心肌炎致死者心肌組織中血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表達及分布特點，探討病毒性心肌炎的發(fā)病、致死機制。方法收集病毒性心肌炎致死案例20例作為實驗組，交通事故致創(chuàng)傷性、失血性休克死亡案例10例作為對照組，取心肌組織切片進行VCAM-1及caspase-3免疫組織化學(xué)染色后顯微鏡下觀察，經(jīng)圖像分析和統(tǒng)計學(xué)處理，比較兩組染色后VCAM-1及caspase-3陽性表達的差異。結(jié)果（1）實驗組VCAM-1免疫組織化學(xué)染色陽性表達呈深棕黃色，染色部位主要位于血管內(nèi)皮細胞內(nèi)，對照組呈微弱陽性表達。實驗組平均光密度高于對照組（P＜0.05）。（2）實驗組caspase-3免疫組織化學(xué)染色陽性表達為棕紅色顆粒，主要位于心肌血管周圍炎癥細胞中，實驗組陽性細胞數(shù)多于對照組（P＜0.05）。結(jié)論VCAM-1可能在病毒性心肌炎引起的炎癥細胞滲出過程中發(fā)揮重要作用，可為病毒性心肌炎致死案例中的法醫(yī)病理學(xué)診斷提供參考，而caspase-3介導(dǎo)的心肌細胞凋亡參與病毒性心肌炎晚期致死機制的作用不明顯。

法醫(yī)病理學(xué)；血管細胞黏附分子-1；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；細胞凋亡；病毒性心肌炎

病毒性心肌炎主要是由柯薩奇病毒（A、B族）、埃可病毒（ECHO）、脊髓灰質(zhì)炎病毒等引起的心肌局限性或彌漫性的感染，嚴重地威脅著人類健康，尤其是男性青壯年。病毒性心肌炎的病理改變主要以心肌細胞變性、壞死及間質(zhì)炎癥細胞浸潤和纖維化為主，然而其發(fā)病機制尚未完全闡明[1]。本研究通過觀察病毒性心肌炎致死者心肌血管內(nèi)皮細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達、血管周圍炎癥細胞的滲出及心肌組織半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表達，探討病毒性心肌炎的早期發(fā)病機制及致死機制，旨在為病毒性心肌炎的法醫(yī)病理診斷及相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

收集2006—2011年中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心尸檢后診斷為病毒性心肌炎致死的案例20例，作為實驗組；因車禍致創(chuàng)傷性休克或失血性休克死亡且心臟無基礎(chǔ)病變的案例10例，作為對照組。

實驗組中男性11例，女性9例，年齡為7～53歲。根據(jù)案情資料，實驗組多以發(fā)熱、感冒、胸痛等為主要首發(fā)癥狀，部分病例還伴有頭痛、腹痛、心悸、嘔吐、腹瀉等癥狀；尸檢時尸斑明顯、雙手指甲床發(fā)紺，體表除醫(yī)源性損傷外未見明顯機械性損傷，腦、肝、脾、肺、腎等重要器官淤血，余未見明顯異常。對照組男性8例，女性2例，年齡為20～57歲，未見上述癥狀表現(xiàn)。

1.2 試劑

兔VCAM-1多克隆抗體（0.2 mL，武漢博士德生物工程有限公司），兔caspase-3單克隆抗體（100μg，美國賽信通公司），生物素化的羊抗兔IgG抗體、即用型SABC免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色試劑（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 HE染色及免疫組織化學(xué)染色

低溫保存尸體1～3d后提取心肌組織，并置于10%甲醛溶液中固定72h后制成蠟塊保存。按常規(guī)制作切片后，分別進行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。

免疫組織化學(xué)染色按照SABC試劑盒說明書進行。PBS緩沖液取代一抗作為空白對照。

1.4 結(jié)果判定及統(tǒng)計學(xué)處理

隨機選取每張切片中5個陽性表達血管視野（×200），使用Image-Pro Plus 6.0軟件測定血管內(nèi)皮細胞內(nèi)VCAM-1抗體陽性反應(yīng)物的平均光密度值及血管周圍caspase-3抗體陽性細胞數(shù)，數(shù)據(jù)用±s表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，以t檢驗進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

實驗組心外膜下、肌層、心內(nèi)膜見大量淋巴細胞彌漫性浸潤，部分心肌組織呈灶樣壞死，間質(zhì)血管擴張、充血，可見廣泛性淋巴細胞及單核細胞浸潤，部分心臟傳導(dǎo)組織中竇房結(jié)、房室結(jié)及希氏束區(qū)也可見大量淋巴細胞浸潤。對照組未見該形態(tài)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 VCAM-1染色

實驗組心肌間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞呈VCAM-1強陽性表達，陽性反應(yīng)物位于血管內(nèi)皮細胞內(nèi)，呈深棕黃色（圖1A），對照組心肌間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞呈VCAM-1微弱陽性表達（圖1B）。兩組平均光密度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

圖1 VCAM-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果SABC×200

表1 VCAM-1免疫組織化學(xué)平均光密度（±s）

表1 VCAM-1免疫組織化學(xué)平均光密度（±s）

組別例數(shù)平均光密度實驗200.2626±0.0190對照100.1768±0.0064

2.2.2 caspase-3染色

實驗組VCAM-1抗體免疫組織化學(xué)表達強陽性的心肌組織中心肌細胞幾乎無陽性表達，但血管周圍可見大量炎癥細胞caspase-3表達陽性（圖2A），對照組VCAM-1抗體免疫組織化學(xué)表達微弱陽性的心肌組織中幾乎無caspase-3陽性表達（圖2B）。兩組陽性細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

圖2 caspase-3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果SABC×200

表2 caspase-3免疫組織化學(xué)陽性細胞數(shù)（±s）

表2 caspase-3免疫組織化學(xué)陽性細胞數(shù)（±s）

組別例數(shù)陽性細胞數(shù)實驗20139.5417±50.1179對照101.2183±0.3927

3 討論

近年來，由病毒性心肌炎導(dǎo)致的青壯年心源性猝死較為常見[2-3]。目前研究[1，4-5]發(fā)現(xiàn)，病毒復(fù)制、炎性介質(zhì)、細胞凋亡、內(nèi)皮細胞功能障礙、免疫調(diào)控失衡、心肌纖維化等多種因素參與病毒性心肌炎的發(fā)病及致死機制。病理性細胞凋亡在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用近年來受到重視，細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可導(dǎo)致細胞凋亡和壞死。

細胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAM）是介導(dǎo)細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的膜表面糖蛋白的統(tǒng)稱，以受體-配體結(jié)合的形式發(fā)揮作用。VCAM-1則是一類糖蛋白分子，是細胞黏附分子免疫球蛋白家族的重要成員之一，廣泛分布于細胞因子活化的內(nèi)皮細胞表面及上皮細胞、單核巨噬細胞和樹突狀細胞表面。VCAM-1參與淋巴細胞的活化和遷移，在炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移、自身免疫性疾病等病理過程中也起重要作用[6]，在炎癥反應(yīng)中淋巴細胞等炎癥細胞的聚集上有重要作用，參與單核-吞噬細胞和淋巴細胞的炎癥部位浸潤，其在血管內(nèi)皮上的表達也被認為是炎癥細胞從血管進入炎癥區(qū)所必需的。正常情況下VCAM-1會有少量表達，但炎癥病理條件下表達會顯著增多。VCAM-1與其配體極遲反應(yīng)抗原-4 （very late antigen-4，VLA-4）相結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)活性，VLA-4主要表達在淋巴細胞等單核細胞上。VCAM-1與細胞表面的VLA-4結(jié)合，使淋巴細胞黏附在內(nèi)皮細胞表面，引起淋巴細胞活化，通過釋放多種顆粒物質(zhì)，破壞內(nèi)皮細胞基底膜使膜脂質(zhì)過氧化、細胞溶解，導(dǎo)致血管內(nèi)皮滲透性增加，淋巴細胞便可以從血管大量滲出，到達炎癥病灶。本實驗結(jié)果表明，實驗組心肌間質(zhì)血管內(nèi)皮VCAM-1表達較對照組顯著增高，證明病毒性心肌炎血管周圍炎癥細胞聚集與VCAM-1升高有關(guān)。大量的炎癥細胞（主要為淋巴細胞）聚集在心肌微血管內(nèi)并浸潤到心肌組織中，可釋放細胞炎性物質(zhì)、氧自由基和蛋白酶等物質(zhì)，引起心肌損傷致死；同時炎癥細胞浸潤可啟動機體免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致心功能障礙。為了證實心肌細胞凋亡所致的損傷和炎癥細胞參與的免疫反應(yīng)造成的損傷類型，本實驗進一步對病毒性心肌炎組織進行caspase-3免疫組織化學(xué)染色。

細胞凋亡是一種基因控制的細胞自殺過程，在此過程中會產(chǎn)生許多凋亡執(zhí)行因子，caspase家族蛋白是細胞凋亡過程中最主要的執(zhí)行因子，其中caspase-3是導(dǎo)致細胞凋亡的最強大的效應(yīng)因子，caspase-3的激活可以作為鑒定凋亡發(fā)生的標準之一[7-8]。caspase-3既參與凋亡啟動，又參與凋亡程序執(zhí)行，尤其在凋亡執(zhí)行階段，負責(zé)對全部或部分關(guān)鍵蛋白進行酶切（激活或滅活），與細胞凋亡關(guān)系密切。其機制可能為：caspase-3能誘導(dǎo)破壞細胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞自穩(wěn)功能嚴重失調(diào)和影響修復(fù)過程，最終使細胞解體[9]。Wang等[10-12]報道在柯薩奇B3病毒（coxsackievirus B3，CVB3）感染的實驗小鼠心肌組織中caspase-3的表達與細胞凋亡相關(guān)，且caspase-3的表達與細胞凋亡強度呈正相關(guān)。本實驗實驗組及對照組心肌細胞幾乎未見caspase-3的陽性表達，但在實驗組心肌間質(zhì)血管周圍的炎癥細胞見顯著的caspase-3表達。由此可以推斷心肌細胞凋亡機制在病毒性心肌炎的晚期致死機制中作用不明顯，而病毒的直接復(fù)制及炎性介質(zhì)參與的免疫作用溶解感染的心肌細胞可能為病毒性心肌炎的主要致死機制[13]。

本研究提示VCAM-1作為一項指標對診斷因病毒性心肌炎導(dǎo)致的心源性猝死具有法醫(yī)學(xué)意義。病毒性心肌炎致死機制并非以心肌細胞的凋亡為主，而是由炎癥介質(zhì)參與的免疫機制造成的心肌損害為主，其具體免疫機制有待進一步研究。

[1]Esfandiarei M，McManus BM.Molecular biology and pathogenesis of viral myocarditis[J].Annu Rev Pathol，2008，3：127-155.

[2]寧娟，李永宏，張純兵.病毒性心肌炎猝死心肌MCP-1表達及其法醫(yī)學(xué)意義[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（5）：334-336.

[3]許弘飛，陳建雷，達徐平，等.CAR在病毒性心肌炎和擴張型心肌病心肌中的表達[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（5）：328-331.

[4]Elamm C，F(xiàn)airweather D，Cooper LT.Pathogenesis and diagnosis of myocarditis[J].Heart，2012，98（11）：835-840.

[5]Yu XH，Li SJ，Chen RZ，et al.Pathogenesis of coxsackievirusB3-inducedmyocarditis：roleof macrophage migration inhibitory factor[J].Chin Med J（Engl），2012，125（1）：50-55.

[6]Seko Y，Yagita H，Okumura K，et al.Expression of vascular cell adhesion molecule-1 in murine hearts with acute myocarditis caused by coxsackievirus B3[J]. J Pathol，1996，180（4）：450-454.

[7]Eldadah BA，F(xiàn)aden AI.Caspase pathways，neuronal apoptosis，and CNS injury[J].J Neurotrauma，2000，17（10）：811-829.

[8]Thornberry NA，Lazebnik Y.Caspases：enemies within[J].Science，1998，281（5381）：1312-1316.

[9]Clarke P，Debiasi RL，Goody R，et al.Mechanisms of reovirus-induced cell death and tissue injury：role of apoptosis and virus-induced perturbation of hostcell signaling and transcription factor activation[J]. Viral Immunol，2005，18（1）：89-115.

[10]王雪峰，周麗，南春紅，等.柴胡提取物對CVB3m感染小鼠心肌細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25（10）：925-928.

[11]常紅，韓波，韓秀珍.抗FasL抗體對小鼠病毒性心肌炎作用機制的研究[J].中華兒科雜志，2005，43（12）：920-924.

[12]Kyt? V，Lapatto R，Lakkisto P，et al.Glutathione depletion and cardiomyocyte apoptosis in viral myocarditis[J].Eur J Clin Invest，2004，34（3）：167-175.

[13]Huber S.T cells in coxsackievirus-induced myocarditis[J].Viral Immunol，2004，17（2）：152-164.

Expression of VCAM-1 and Caspase-3 in Myocardium of Persons Who Died from Viral Myocarditis

GAO Di1,TANG Xin-hua2,HUANG Jing-lu1,HAO Bo1,TANG Da-wei1,LI Ming1,LUO Bin1
（1.Department of Forensic Medicine,Zhongshan Medical College,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080, China;2.Dongyuan Public Security Bureau,Dongyuan 517500,China）

ObjectiveTo observe the expression and distribution of vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1）and caspase-3 in myocardium of persons who died from viral myocarditis and to explore its pathogenesis and death mechanism.MethodsTwenty cases died from viral myocarditis were selected as the experimental group.Ten cases died from traumatic shock and massive hemorrhage shock after traffic accidents were selected as the control group.The sections of myocardium were stained by immunohistochemistry for VCAM-1 and caspase-3,and observed under microscope.The positive expressions of VCAM-1 and caspase-3 of the two groups were compared with each other by image analysis and statistical analysis.Results（1）The vascular endothelial cells expressed VCAM-1 with dark nigger-brown colors in the experimental group,and weak expression was observed in the control group.The average optical density in the experimental group was higher than that in the control group（P＜0.05）.（2）The caspase-3 positive cells were mostly inflammatory cells around the myocardial vessels with brown-red granules in the experimental group.The positive cell number in the experimental group was higher than that in the control group（P＜0.05）.ConclusionVCAM-1 may play an important role in the inflammatory cells exudation caused by viral myocarditis,and may provide the reference for diagnosis of viral myocarditis in forensic pathology.However,the myocardial apoptosis mediated by caspase-3 doesn’t affect the lethal mechanism in the late stage of viral myocarditis.

forensic pathology;vascular cell adhesion molecule-1;caspase-3;apoptosis;vital myocarditis

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.03.001

1004-5619（2013）03-0161-03

2012-11-09）

（本文編輯：劉寧國）

國家自然科學(xué)基金資助項目（39700167）

高迪（1985—），男，山東龍口人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：gaodi2008@qq.com

羅斌，男，主任法醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)（猝死疾病）研究；E-mail：luobin@mail.sysu.edu.cn