徐小龍，王雯，劉超，侯一丁，黃雷，劉長暉，李越，成建定

（1.深圳市公安局坪山分局，廣東深圳 518118；2.深圳市公安局羅湖分局，深圳羅湖 518004；3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東廣州 510030；4.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510080）

GPD1-L基因檢測及其與青壯年猝死綜合征的相關(guān)性

徐小龍1，王雯2，劉超3，侯一丁4，黃雷4，劉長暉3，李越3，成建定4

（1.深圳市公安局坪山分局，廣東深圳 518118；2.深圳市公安局羅湖分局，深圳羅湖 518004；3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東廣州 510030；4.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510080）

目的探尋甘油-3-磷酸脫氫酶樣基因（glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene，GPD1-L）的變異位點(diǎn)，討論其與青壯年猝死綜合征（sudden manhood death syndrome，SMDS）的關(guān)系。方法提取SMDS組及健康對照組血樣的基因組DNA，采用PCR法擴(kuò)增GPD1-L基因編碼區(qū)外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)以及3′側(cè)翼區(qū)序列，直接進(jìn)行DNA測序以明確遺傳變異類型，并進(jìn)行基因型頻率和等位基因頻率的統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果在SMDS組中共檢測到2個變異位點(diǎn)，c.465C＞T和c.*18G＞T，后者在SMDS組和對照組中基因型分布和等位基因頻率存在一定差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論GPD1-L基因變異與中國人SMDS發(fā)生的相關(guān)性尚有待進(jìn)一步研究。

法醫(yī)遺傳學(xué)；青壯年猝死綜合征；甘油-3-磷酸脫氫酶樣基因

青壯年猝死綜合征（sudden manhood death syndrome，SMDS）是一種迄今為止原因未明，主要好發(fā)于泰國、老撾、柬埔寨、日本、中國等東南亞國家的猝死病癥。在部分地區(qū)的青壯年死因中僅次于交通事故的第二大死因。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，對基因突變及單核苷酸多態(tài)性（SNP）在解釋復(fù)雜多基因疾病的致病原因及發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識逐漸深入，有學(xué)者[1-4]發(fā)現(xiàn)，部分SMDS與編碼人心臟電壓門腔鈉離子通道α亞基（Nav1.5）的SCN5A基因的結(jié)構(gòu)異常密切相關(guān)。人心臟鈉離子通道可以看作是由形成孔道的α亞基（Nav1.5）、調(diào)節(jié)性β亞基及其他相關(guān)作用蛋白一起構(gòu)成的多蛋白復(fù)合體（multi-protein complex），對心臟鈉離子通道的功能有重要調(diào)節(jié)作用，其基因結(jié)構(gòu)異常也可引起心臟鈉離子通道功能缺陷相關(guān)的疾病[5-6]。

London等[7]的研究顯示，編碼甘油-3-磷酸脫氫酶樣基因（glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene，GPD1-L）的基因錯義突變可導(dǎo)致鈉通道向心肌細(xì)胞膜表面的轉(zhuǎn)運(yùn)受限，鈉離子內(nèi)流減少，引起B(yǎng)rugada綜合征。前期研究[8-10]發(fā)現(xiàn)，SMDS在臨床表型、猝死誘因、SCN5A分子遺傳學(xué)方面與以Brugada綜合征為主要代表的心臟鈉離子通道疾病高度相似，故本研究假設(shè)GPD1-L基因突變有可能通過影響Nav1.5的表達(dá)和功能，從而與部分SMDS發(fā)生相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SMDS組

收集2005年2月—2012年3月猝死于廣東省廣州、東莞、深圳、佛山、珠海等地區(qū)的男性散發(fā)個體SMDS病例血紗樣本123例，籍貫主要為廣東、湖南、江西、四川、福建等地區(qū)。

SMDS組入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）生前身體健康，發(fā)育營養(yǎng)良好；（2）青壯年（17～45歲）；（3）死于夜間睡眠中，以凌晨2～4時為多見，偶見于午睡中猝死；（4）死因鑒定未查見足以解釋死因的病理學(xué)變化。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）排除物理、化學(xué)、生物及機(jī)械等暴力因素致死的病例；（2）排除有明確死因或生前患有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌炎、心肌病等器質(zhì)性心臟疾病及高血壓、糖尿病、其他代謝性疾病病例；（3）死因可疑病例。

1.1.2 對照組

收集2005年2月—2012年3月在中山大學(xué)法醫(yī)鑒定中心做親子鑒定的男性無關(guān)個體（20～49歲）血紗樣本102例，籍貫主要為廣東、廣西、江西、福建、湖南等地區(qū)，無心血管疾病史及暈厥史，體格檢查正常。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

使用磁性DNA半定量提取試劑盒（長春博坤生物科技有限公司）從白細(xì)胞中抽提DNA，剪取3mm× 3mm大小血紗于96孔提取板中（1mL深孔板），并按操作說明放置在DNA自動化提取工作站（煙臺澳斯邦公司）相應(yīng)位置，啟動程序，約2.5h后程序運(yùn)行結(jié)束，模板DNA自動收集至U型板中，4℃保存?zhèn)溆谩Ｉ俨糠株惻f、血跡較淡的樣本在Maxwell 16核酸自動純化儀（美國Promega公司）上經(jīng)DNA IQ試劑盒（美國Promega公司）純化。

1.2.2 擴(kuò)增DNA目的片段

根據(jù)Genebank已知人類GPD1-L基因序列（NCBI ID：NM_015141.3），合成引物序列（表1）。擴(kuò)增SMDS 組GPD1-L基因編碼區(qū)外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)以及3′側(cè)翼區(qū)序列，在9700型擴(kuò)增儀（美國AB公司）上進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：GoTaq?Green Master Mix（2×）15 μL，正向引物1 μL（10 μmol/L），反向引物1 μL （10 μmol/L），DNA模板2 μL，加ddH2O 11 μL至總體積30 μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃2min；95℃30s，60℃40s，72℃50s，35個循環(huán)；72℃10min，4℃保存。

表1 PCR特異性引物

1.2.3電泳

PCR產(chǎn)物5 μL與參標(biāo)DL2000 DNA Marker經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（100 V，30 min），溴化乙啶染色后在紫外燈下觀察PCR產(chǎn)物的目的條帶。

1.2.4 直接測序與結(jié)果比對

對所有PCR產(chǎn)物過膜純化后進(jìn)行測序，測序引物與PCR引物相同，所有可疑突變均經(jīng)反向測序確定。純化、測序過程由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。測序結(jié)果用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對，與Genebank人類GPD1-L標(biāo)準(zhǔn)序列（NCBI ID：NM_015141.3）對比，檢測到的突變序列采用重復(fù)測序驗證，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分析突變所導(dǎo)致的氨基酸改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件包，計算SMDS組與對照組的基因型頻率和等位基因頻率，并檢驗是否符合Hardy-Weinberg平衡，兩組計數(shù)資料比較用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SMDS組檢測到的GPD1-L基因變異

對GPD1-L基因所有編碼區(qū)外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)以及3′側(cè)翼區(qū)進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)2個遺傳變異（圖1～2）。c.465C＞T位于4號外顯子，第155位氨基酸丙氨酸（Ala）沒有發(fā)生改變，其在SMDS組中的檢出率（變異個體數(shù)/檢測總例數(shù)）僅為0.97%，在對照組中的檢出率為0（表2）。c.*18G＞T位于3′側(cè)翼區(qū)，不編碼氨基酸，其在SMDS組中的檢出率為12.5%，在對照組中的檢出率為10.8%（表2）。

圖1 GPD1-L基因變異位點(diǎn)c.465C＞T正向測序比對結(jié)果

圖2 GPD1-L基因變異位點(diǎn)c.*18G＞T正向測序比對結(jié)果

2.2 GPD1-L基因c.*18G＞T與SMDS的相關(guān)性

在SMDS組和對照組中均發(fā)現(xiàn)GPD1-L基因存在c.*18G＞T，并以高頻形式出現(xiàn)，經(jīng)χ2檢驗，基因型在SMDS組和對照組中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），比較組間基因型頻率和等位基因頻率的差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 GPD1-L基因變異位點(diǎn)

表3 SMDS組與對照組GPD1-L基因多態(tài)位點(diǎn)c.*18G＞T的基因型頻率和等位基因頻率［例（%）］

3 討論

人類GPD1-L基因可編碼由351個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其與GPD有84%的同源性。GPD是一種二聚體蛋白，參與磷酸甘油穿梭作用，將胞漿中NADH的電子轉(zhuǎn)移給線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)鏈，影響能量產(chǎn)生、滲透調(diào)節(jié)、腫瘤生長和凋亡[7，11]。2002年，Weiss等[11]在對Brugada綜合征的研究中首次報道了GPD1-L這一候選基因，它定位于3號染色體上，與Ⅱ型Brugada綜合征有關(guān)，隨后研究證明這個基因在心肌細(xì)胞膜表面與SCN5A編碼的Nav1.5共表達(dá)。

Van Norstrand等[12]在83例年齡為（14.6±10.7）歲突發(fā)性猝死綜合征（sudden unexpected death syndrome，SUDS）病例以及隨后的221例嬰幼兒猝死綜合征（sudden infant death syndrome，SIDS）病例中檢測到GPD1-L基因的3個變異位點(diǎn)，分別是E83K、I124V和R273C，3個位點(diǎn)都呈高度保守狀態(tài)，并且在300例對照組中未檢出。在瞬時轉(zhuǎn)染上述突變體的HEK細(xì)胞及新生大鼠心肌細(xì)胞中，均證實(shí)突變體可使鈉電流密度下降。進(jìn)一步機(jī)制研究表明，GPD1-L基因與SCN5A基因在細(xì)胞膜表面共表達(dá)，提示二者之間可能存在直接的相互作用；GPD1-L基因可能與離子通道有相互作用的蛋白質(zhì)發(fā)生作用，如ankyrin-G、syntrophin、caveolin-3、Nedd4-2[13-14]；GPD1-L基因通過影響蛋白激酶A依賴的磷酸化作用，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號[15-16]；GPD1-L基因影響氧化狀態(tài)來調(diào)節(jié)心臟鈉離子通道的功能[16-17]。

London等[7]在有16例典型病例及27例其他成員的Brugada綜合征的大家系研究中發(fā)現(xiàn)，GPD1-L基因的變異位點(diǎn)A280V在300例對照組中未檢出。過表達(dá)野生型GPD1-L使SCN5A基因在HEK細(xì)胞鈉電流無明顯改變，而過表達(dá)A280V GPD1-L卻使鈉電流下降了約48%，但A280V不影響激活期和失活期鈉通道的動力學(xué)參數(shù)，也不改變失活、復(fù)活的進(jìn)程，從失活期復(fù)活的時間常數(shù)也不受影響。與野生型GPD1-L相比，A280V使SCN5A基因在HEK293細(xì)胞膜表面的表達(dá)下降了48%，從而推測A280V可能是通過干擾細(xì)胞內(nèi)GPD1-L基因的定位從而降低膜表面SCN5A基因的表達(dá)，導(dǎo)致鈉電流的下降引起B(yǎng)rugada綜合征。

Makiyama等[18]在80例Brugada綜合征病例中檢測到GPD1-L基因的1個同義突變c.465C＞T（p.A155A）及1個內(nèi)含子變異c.48-30T＞C，這兩個變異在220例對照組中均未發(fā)現(xiàn)，此外，發(fā)現(xiàn)1個SNP位點(diǎn)c.*21G＞T位于3′側(cè)翼區(qū)，其在SMDS組和對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

上述研究表明，GPD1-L基因?qū)π募♀c通道具有重要的功能調(diào)節(jié)作用，是Brugada綜合征、SIDS以及SMDS的重要易感基因。本研究以SMDS散發(fā)病例和健康對照人群作為研究對象，篩查GPD1-L基因的可能遺傳變異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個變異位點(diǎn)。其中，c.465C＞T （p.A155A）為同義多態(tài)，位于4號外顯子，其參與編碼的第155位氨基酸丙氨酸未改變，但本實(shí)驗只檢出1例且為雜合型，其在SMDS組中的檢出率為0.97%，病理生理意義不明，有待進(jìn)一步研究。然而，c.*18G＞T位于3′側(cè)翼區(qū)，作為一個高頻率SNP位點(diǎn)在SMDS組和對照組中廣泛存在，進(jìn)一步比較各組基因型頻率和等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)其差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但此類非編碼區(qū)變異是否通過調(diào)控GPD1-L基因的表達(dá)而影響SMDS的易感性尚有待進(jìn)一步闡明。

本研究從“心臟鈉離子通道疾病是SMDS原發(fā)病因之一”這一假說出發(fā)，檢測了中國人GPD1-L基因的變異情況。在本次所檢測的中國人SMDS病例中未發(fā)現(xiàn)GPD1-L外顯子的已報道的或新的非同義突變，故GPD1-L基因的結(jié)構(gòu)與功能異常是否與中國人SMDS的易感性相關(guān)尚有待擴(kuò)大樣本量和功能研究后進(jìn)行探索和驗證。

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（本文編輯：黃平）

Gene Detection of GPD1-L and the Association with Sudden Unexplained Death Syndrome in Young Adults

XU Xiao-long1,WANG Wen2,LIU Chao3,HOU Yi-ding4,HUANG Lei4,LIU Chang-hui3,LI Yue3,CHENG Jian-ding4
（1.Pingshan Branch of Shenzhen Public Security Bureau,Shenzhen 518118,China;2.Luohu Branch of Shenzhen Public Security Bureau,Shenzhen 518004,China;3.Guangzhou Institute of Criminal Science and Technology,Guangzhou 510030,China;4.Department of Forensic Medicine,Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510080,China）

ObjectiveTo analyze the variations of glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene（GPD1-L）and address the association with sudden manhood death syndrome（SMDS）.MethodsThe genomic DNA was extracted from blood samples of the SMDS group and the normal control group.The exons,exon-intron boundaries and 3′-UTRs of coding region of GPD1-L were PCR amplified and DNA sequenced directly to confirm the types of variations.The genotype frequency and allele frequency were analyzed statistically.ResultsThere were two variants in the SMDS group,c.465C＞T and c.*18G＞T,the latter existed certain degree difference of genotype distribution and allele frequency between the SMDS group and the control group,but there was no statistically significant（P＞0.05）.ConclusionThe relation between gene mutation of GPD1-L and the occurrence of Chinese SMDS deserves a further research.

forensic genetics;sudden manhood death syndrome;glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 like gene

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.008

1004-5619（2013）05-0348-05

國家自然科學(xué)基金面上項目（81172901）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金項目（11ykpy04）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK02B02）

徐小龍（1977—），男，湖北黃岡人，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：992081468@qq.com

成建定，男，教授，主任法醫(yī)師，主要從事猝死的分子病理學(xué)及細(xì)胞電生理學(xué)研究；E-mail：chengjd@mail.sysu.edu.cn

2012-08-21）