李東，李如波，林巨里

（中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)研究室，遼寧沈陽 110001）

·綜述·

金屬硫蛋白-Ⅰ/Ⅱ在腦損傷修復(fù)中的機制及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

李東，李如波，林巨里

（中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)研究室，遼寧沈陽 110001）

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一種金屬結(jié)合蛋白，其中MT-Ⅰ/Ⅱ是其重要成員，能夠調(diào)節(jié)腦內(nèi)金屬離子代謝和解毒以及清除自由基，具有抗炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激的作用，對腦組織有保護作用。最新研究表明，MT-Ⅰ/Ⅱ可刺激腦內(nèi)抗炎因子、生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的表達(dá)，并可促進(jìn)神經(jīng)元軸突延長，有利于神經(jīng)元再生，在腦損傷修復(fù)過程中起重要作用?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本文對MT-Ⅰ/Ⅱ的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、分布、調(diào)節(jié)，在腦損傷修復(fù)中的作用及機制，同時也對其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景進(jìn)行闡述，為腦損傷藥物的研制和腦創(chuàng)傷時間的推斷提供新的思路。

法醫(yī)病理學(xué)；金屬硫蛋白；綜述[文獻(xiàn)類型]；腦損傷

金屬硫蛋白（metallothionein，MT），1957年由Va?ák等[1]在馬的腎皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，是一種小型富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，在哺乳動物中有4種異構(gòu)體（MT-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中對MT-Ⅰ/Ⅱ的研究最為廣泛。MT-Ⅰ/Ⅱ可調(diào)節(jié)多種與腦損傷相關(guān)的因子，促進(jìn)神經(jīng)元的再生，在腦損傷修復(fù)過程中起重要作用。本文綜述了MT-Ⅰ/Ⅱ的結(jié)構(gòu)、表達(dá)、分布、調(diào)節(jié)，在腦損傷修復(fù)中的作用及機制，同時也對其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景進(jìn)行闡述，為腦損傷藥物的研制和腦創(chuàng)傷時間的推斷提供新的思路。

1 MT-Ⅰ/Ⅱ的結(jié)構(gòu)、表達(dá)和分布

MT-Ⅰ/Ⅱ是一類相對分子質(zhì)量（6 000～7 000）較低的金屬結(jié)合蛋白，哺乳動物的MT含61～62個氨基酸殘基，其中半胱氨酸含量約占三分之一，Va?ák等[1]發(fā)現(xiàn)MT中沒有芳香族氨基酸，且半胱氨酸均為還原性，有特殊的Cys-X-Cys、Cys-X-Cys-Cys、Cys-X-XCys結(jié)構(gòu)重復(fù)出現(xiàn)。MT-Ⅰ/Ⅱ的空間結(jié)構(gòu)包括α、β兩個球形結(jié)構(gòu)域，當(dāng)金屬離子結(jié)合到載體蛋白上時，多肽鏈將迅速在每個結(jié)構(gòu)域折疊成兩個三維立體的金屬硫蛋白簇。在生理條件下，人體大腦中MT-Ⅰ/Ⅱ的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)很少，星形膠質(zhì)細(xì)胞是MT-Ⅰ/Ⅱ的主要來源，普遍認(rèn)為MT-Ⅰ/Ⅱ在星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)水平是神經(jīng)元的數(shù)倍。在前期研究[2]中，MT-Ⅰ/Ⅱ被嚴(yán)格認(rèn)定為一種細(xì)胞內(nèi)功能蛋白，已證實具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)金屬離子代謝、解毒及清除自由基等功能。但最近大量數(shù)據(jù)顯示MT-Ⅰ/Ⅱ在細(xì)胞內(nèi)外都有分布并起作用[1，3]。實驗表明[3]星形膠質(zhì)細(xì)胞可能分泌MT-Ⅰ/Ⅱ到細(xì)胞外來保護周圍的神經(jīng)元，增強其生存、分化和傷后恢復(fù)能力，該實驗還發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷性腦損傷、腦缺血或在神經(jīng)退行性疾病等模型中，MT-Ⅰ/Ⅱ在細(xì)胞外也起著重要作用，對腦損傷動物注射外源性MT-Ⅰ/Ⅱ也同樣能對神經(jīng)元起到保護作用。

2 MT-Ⅰ/Ⅱ的調(diào)節(jié)

MT-Ⅰ/Ⅱ基因表達(dá)具有很高的誘導(dǎo)性，很多病理條件都能迅速增加MT-Ⅰ/Ⅱ基因的表達(dá)。施加適量或過多的金屬離子如Zn2+、Cu2+、Cd2+、Hg2+可以通過位于起始密碼區(qū)的DNA順勢作用元件——金屬應(yīng)答元件（metal responsive element，MRE）來增加MT-Ⅰ/Ⅱ的生物合成。MRE結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（metal transcription factor-1，MTF-1）是一個多鋅指蛋白，而且是唯一已知的MT-Ⅰ/Ⅱ金屬應(yīng)答元件調(diào)控因子。當(dāng)金屬與MTF-1結(jié)合時，MT-Ⅰ/Ⅱ的轉(zhuǎn)錄開始。而在Zn2+缺失試驗中，MTF-1可能會形成Zn2+應(yīng)答抑制物復(fù)合體，阻止MTF-1與MRE反應(yīng)，使得MT-Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄受到抑制[1，4]，除了金屬離子之外，活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基與氧化應(yīng)激也能提高M(jìn)T-Ⅰ/Ⅱ的表達(dá)，其機制與起始密碼子區(qū)的抗氧化應(yīng)激元件（antioxidant response element，ARE）有關(guān)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)過程中，炎癥因子如白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-3、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophagecolony stimulating factor，M-CSF）和干擾素都可以提高M(jìn)T-Ⅰ/Ⅱ的表達(dá)。此外，糖皮質(zhì)激素如皮質(zhì)酮、地塞米松等也可通過糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（glucocorticoid response element，GRE）激活MT-Ⅰ/Ⅱ基因轉(zhuǎn)錄[5]。

3 MT-Ⅰ/Ⅱ在腦損傷中的作用

MT-Ⅰ/Ⅱ具有抗炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激的作用。Prado等[6-7]通過對MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除小鼠與MT-Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)基因過表達(dá)小鼠以及野生小鼠的對比發(fā)現(xiàn)，MT-Ⅰ/Ⅱ可以抑制炎癥因子如IL-1、IL-3、IL-6、IL-12的表達(dá)，還可抑制TNF-α、淋巴毒素-α（lymphotoxin-α，LT-α）、巨噬細(xì)胞活化因子-1（macrophage activating factor，MAC-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達(dá)，從而有效抑制白細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。由此推斷，MT-Ⅰ/Ⅱ可以直接作用于細(xì)胞表面來抑制炎性細(xì)胞，并以此改變炎性細(xì)胞間的附著作用。還有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，MT-Ⅰ/Ⅱ可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達(dá)，具有抗氧化功能，能減少誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）水平，蛋白質(zhì)硝化，脂質(zhì)過氧化，DNA氧化損傷以及DNA碎片水平。此外，Pedersen等[7]發(fā)現(xiàn)在各種腦損傷實驗中，MT-Ⅰ/Ⅱ過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)抗炎因子、生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的表達(dá)增多，如IL-10、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）、轉(zhuǎn)化生長因子受體（transforming growth factor receptor，TGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophic factor，NTF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）等。由這些因子在腦內(nèi)的作用可知，MT-Ⅰ/Ⅱ在神經(jīng)元的保護與再生，腦損傷灶內(nèi)的血管再生，腦組織的修復(fù)、重塑與瘢痕形成，腦細(xì)胞周期改變、增殖，以及減輕由于各種原因引起的腦細(xì)胞壞死和凋亡等方面有重要作用。Asmussen等[10]還發(fā)現(xiàn)MT-Ⅰ/Ⅱ治療小鼠軸突長度比野生型小鼠軸突長度增加了2.8倍，表明MT-Ⅰ/Ⅱ在腦損傷后神經(jīng)元再生，軸突延長方面有重要作用，MT-Ⅰ/Ⅱ的應(yīng)用有利于腦損傷的恢復(fù)。

4 MT-Ⅰ/Ⅱ作用的分子機制

至今，MT-Ⅰ/Ⅱ發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)以及神經(jīng)保護功能的具體機制尚未完全闡明。在抗炎癥反應(yīng)方面，Pankhurst等[11]發(fā)現(xiàn)，MT-Ⅰ/Ⅱ基因敲除小鼠可以增加循環(huán)白細(xì)胞數(shù)以及改變巨噬細(xì)胞表型，MT-Ⅰ/Ⅱ可能直接作用于炎性細(xì)胞，并以此改變炎性細(xì)胞間的附著作用。MT-Ⅰ/Ⅱ可特異的結(jié)合于巨噬細(xì)胞改變其表型，也可結(jié)合于T、B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，抑制白細(xì)胞激活和增殖。

在MT-Ⅰ/Ⅱ促進(jìn)神經(jīng)元再生、分化、軸突延長方面，公認(rèn)的機制是MT-Ⅰ/Ⅱ可能通過神經(jīng)元上受體直接作用于神經(jīng)元細(xì)胞，使神經(jīng)元在腦損傷中得以存活和再生。研究外源性MT-Ⅰ/Ⅱ治療作用機制時發(fā)現(xiàn)，外源性MT-Ⅰ/Ⅱ通過JAK-STAT信號通路和RhoA信號通路誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞增生，以釋放更多的內(nèi)源性MT-Ⅰ/Ⅱ作用于損傷的神經(jīng)細(xì)胞，起保護作用[12]。Asmussen等[10]進(jìn)一步研究證實MT-Ⅰ/Ⅱ以及一種類MT-Ⅰ/Ⅱ的小分子肽EmtinB在細(xì)胞外通過與神經(jīng)元在細(xì)胞上的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2結(jié)合，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)元再生和軸突延長。對EmtinB的進(jìn)一步研究[13]表明，EmtinB序列中間部分的一個CKCK序列對其促進(jìn)軸突延長作用有重要意義，CKCK片段可能與受體Megalin的結(jié)合有關(guān)，EmtinB因其小分子的結(jié)構(gòu)，在腦損傷藥物治療上有重要意義。Asmussen等[14]還發(fā)現(xiàn)MT-Ⅰ/Ⅱ誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元的突起生長依賴一個異三聚體G蛋白偶酸激酶。Leung等[15]對周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元，如背根神經(jīng)節(jié)進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)MT-Ⅰ/Ⅱ促進(jìn)背根神經(jīng)元再生涉及Megalin，使用Megalin競爭性拮抗劑RAP可以抑制這種再生，而應(yīng)用絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）抑制劑PD98059也可完全抑制軸突的生長，表明MT-Ⅰ/Ⅱ通過MAPK途徑及Megalin受體機制促進(jìn)背根神經(jīng)元再生。Pankhurst等[16]發(fā)現(xiàn)腦損傷可以導(dǎo)致肝MT-Ⅰ/Ⅱ表達(dá)增加，從而導(dǎo)致肝對Zn2+的封存，可能會影響腦損傷后肝的反應(yīng)，表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)外的MT-Ⅰ/Ⅱ也可能會對腦損傷產(chǎn)生影響。

5 MT-Ⅰ/Ⅱ在腦損傷治療中的應(yīng)用前景及法醫(yī)學(xué)意義

對MT-Ⅰ/Ⅱ本體結(jié)構(gòu)及其神經(jīng)元保護作用機制的研究為腦損傷及神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的研究方向。Manso等[17]發(fā)現(xiàn)，不僅完整的MT-Ⅰ/Ⅱ?qū)ρ装Y反應(yīng)有作用，單獨的α、β結(jié)構(gòu)域甚至其中的一小段氨基酸序列也能起到類似的抗炎癥反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激的作用，鑒于小分子藥物更容易通過血腦屏障，為腦損傷藥物的治療提供了新的思路?；贛T-Ⅰ/Ⅱ本體結(jié)構(gòu)得到的EmtinB等小分子肽因同樣能與受體Megalin結(jié)合起到促進(jìn)軸突延長和神經(jīng)元再生的作用，可能被視為一個治療各種腦損傷及神經(jīng)退行性疾病相關(guān)疾病的候選藥物之一。

在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面，顱腦損傷是法醫(yī)學(xué)中常見的損傷類型。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，腦損傷后細(xì)胞的死亡變化機制非常復(fù)雜，涉及腦內(nèi)各種因子的變化，各種因子之間的變化也會產(chǎn)生相互作用。腦損傷、各種因素導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷以及腦組織本身的修復(fù)三種過程同時發(fā)生，作用錯綜復(fù)雜。以往對腦損傷后時間、生前傷與死后傷的推斷的研究多集中于通過單因子的變化推斷腦損傷時間，如許多研究表明，在大鼠腦損傷模型中，基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3， MMP-3）[18-19]、膠質(zhì)纖維酸性蛋白質(zhì)（glial fibrillary acidic protein，GFAP）[20]、GDNF[18]等因子的表達(dá)變化與時間有一定關(guān)系，有可能成為腦損傷后時間推斷的判斷依據(jù)，但是也有研究[20]表明，不同原因腦損傷后這些因子的變化并不一致，且易受其他因素干擾且不夠準(zhǔn)確，相比之下，各種因子其基因表達(dá)在時間和空間上的配合和聯(lián)系對于腦損傷后時間推斷更為重要。MT-Ⅰ/Ⅱ的變化可同時引起iNOS、VEGF、BDNF、ICAM-1、GDNF[7]、GFAP、MMP[16-17]等多因子的變化，這些因子的時序性變化可用于腦損傷后時間推斷的多指標(biāo)綜合性分析。除此之外，Asmussen等[14]對MT促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)元軸突的延伸機制及其規(guī)律的研究，可為腦損傷后時間推斷提供新的組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)。

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（本文編輯：張建華）

Metallothionein-Ⅰ/Ⅱin Brain Injury Repair Mechanism and Its Application in Forensic Medicine

LI Dong,LI Ru-bo,LIN Ju-li
（Department of Forensic Pathology,School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110001, China）

Metallothionein（MT）is a kind of metal binding protein.As an important member in metallothionein family,MT-Ⅰ/Ⅱ regulates metabolism and detoxication of brain metal ion and scavenges free radicals.It is capable of anti-inflammatory response and anti-oxidative stress so as to protect the brain tissue.During the repair process of brain injury,the latest study showed that MT-Ⅰ/Ⅱ could stimulate brain anti-inflammatory factors,growth factors,neurotrophic factors and the expression of the receptor, and promote the extension of axon of neuron,which makes contribution to the regeneration of neuron and has important effect on the recovery of brain injury.Based on the findings,this article reviews the structure,expression,distribution,adjustion,function,mechanism in the repair of brain injury of MT-Ⅰ/Ⅱ and its application prospect in forensic medicine.It could provide a new approach for the design and manufacture of brain injury drugs as well as for age estimation of the brain injury.

forensic pathology;metallothionein;review[publication type];brain injury

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.012

1004-5619（2013）05-0365-03

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目（L201331）

李東（1993—），女，遼寧葫蘆島人，臨床醫(yī)學(xué)七年制學(xué)生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：ldcdl2010@163.com

李如波，男，博士，教授，主要從事腦死亡及彌漫性腦損傷的法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：rbli@mail.cmu.edu.cn

2012-05-30）