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        同型半胱氨酸對(duì)BMVECs 凋亡相關(guān)基因BCL-2/BAX 表達(dá)的影響

        2013-03-11 08:19:54孫文萍謝春香趙節(jié)緒
        關(guān)鍵詞:途徑檢測(cè)

        孫文萍,謝春香,趙節(jié)緒

        高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HHcy)引起動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)的機(jī)制還不完全清楚,但是研究發(fā)現(xiàn),同型半胱氨酸可以破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)其凋亡,造成內(nèi)皮功能障礙[1,2],這是其中一項(xiàng)重要的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)大鼠的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells,BMVECs),研究同型半胱氨酸促使BMVECs 產(chǎn)生凋亡的可能途徑。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        RPMI-1640 培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Gibco,美國(guó));膠原酶Ⅱ型(sigma,美國(guó))、促內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Roche,美國(guó))、D,L-homocysteine(Hcy)(Sigama美國(guó))、生物素化山羊抗兔IgG(北京中山試劑公司)、兔抗NF-κB p65 多克隆抗體(Santa Cruz,美國(guó)),總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Sigama,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、引物購(gòu)自上海生工。

        1.2 方法

        1.2.1 BMVECs 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

        本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)培養(yǎng)成功并通過(guò)Ⅷ因子抗原免疫染色鑒定的大鼠BMVECs,取第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2 MTT 實(shí)驗(yàn)

        按1×103~1×104/ml 密度接種細(xì)胞于96 孔培養(yǎng)板中,分成兩大組,待細(xì)胞貼壁后一組加不同濃度藥物(Hcy 50μmol/L、Hcy 200μmol/L、Hcy 1000μmol/L、Hcy 2000μmol/L)和CuSO4(4μmol/L)共同培養(yǎng)18h;另一組只加不同濃度的Hcy 進(jìn)行培養(yǎng),每種濃度平行8 孔;另設(shè)對(duì)照組。干預(yù)18h 后每孔加入MTT 溶液20ml,37℃,繼續(xù)孵育4h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,然后每孔加入150ml DMSO,振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解;選擇570nm波長(zhǎng),以空白培養(yǎng)液調(diào)零點(diǎn),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值A(chǔ),記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,繪制時(shí)間、劑量效應(yīng)曲線。

        1.2.3 細(xì)胞免疫化學(xué)法(ABC 法)檢測(cè)NF-κB p65 的表達(dá)

        細(xì)胞爬片后固定、封閉,分別加入一抗和二抗后顯色,于Luzex-F 圖像分析儀(加拿大)下計(jì)數(shù)每張片子5 個(gè)視野的NF-κB p65 陽(yáng)性細(xì)胞率。

        1.2.4 蛋白質(zhì)免疫印記分析(Western-bolt 法)NF-κB p65 的表達(dá)

        取1×107細(xì)胞提取胞核蛋白,電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,用含5%脫脂奶粉的PBS液浸泡硝酸纖維膜,以封閉非特異抗體結(jié)合。加入一抗兔抗NF-κB p65 多克隆抗體(1∶1000),常溫下?lián)u振4h,加二抗HRP 羊抗兔IgG(1∶5000)常溫下?lián)u振2h。ECL 檢測(cè)試劑盒顯影,X 線壓片曝光,HPIAS-1000 型圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

        1.2.5 RT-PCR 法檢測(cè)Bax 及Bcl-2 的表達(dá)

        BMVECs 分為4 組,分別加入1mmol/L 的Hcy及4μmol/L CuSO4,各培養(yǎng)0、6、12 和18h 后,分別收集細(xì)胞,提取總RNA,以2μg 總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增Bcl-2(正義引物:5 ’-CACCC2CTGGCATCTTCT-CCTT-3’,反義引物:5’-CACAATCCTCCCCCAGTTCACC-3’,),擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為304bp;Bax(正義引物:5’-ATGGCTGGGGAGACACCTGAG-3 ’,反義引物:5 ’-CTAGCAAAGTAGAAGAGGGCAAC-3’);,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為240 bp;內(nèi)參照β-actin(正義引物:5’-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3’,反義引物:5 ’-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3’),擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為764 bp。擴(kuò)增條件:94 ℃變性1min,55 ℃退火1min,72 ℃延伸2min,循環(huán)35 次。擴(kuò)增完畢后取PCR 產(chǎn)物10μl 于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè),凝膠圖像分析儀(法國(guó)VL 公司,Bio-ID)分析。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 MTT 結(jié)果

        細(xì)胞培養(yǎng)18h 后,我們發(fā)現(xiàn),單獨(dú)添加Cu-SO(4μmol/L)組的細(xì)胞存活率沒(méi)有受到影響;培養(yǎng)液中不含CuSO4(4μmol/L)時(shí),各Hcy 濃度組細(xì)胞OD570 值無(wú)顯著區(qū)別(P>0.05);當(dāng)培養(yǎng)液中添加CuSO4(4μmol/L)時(shí),Hcy 濃度為1mmol/L 及2 mmol/L 的兩組細(xì)胞OD570 值明顯降低(P 分別為0.034 和0.006),而 Hcy 濃度為50μmol/L、200μmol/L 的兩組細(xì)胞OD570 值較對(duì)照組差異不顯著(P>0.05))。因此以后的試驗(yàn)中,我們選用的Hcy 干預(yù)濃度為1 mmol/L(含CuSO44μmol/L)。

        2.2 NF-κB p65 表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

        正常情況下,即血管內(nèi)皮細(xì)胞未受到外界刺激時(shí),由于NF-κB 和IκB-α 蛋白質(zhì)結(jié)合成三聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì),NF-κB 處于未活化狀態(tài)。故1mmol/L 的Hcy+4 μmol/L CuSO4干預(yù)細(xì)胞后,0h 組細(xì)胞染色后NF-κB p65 只在細(xì)胞漿表達(dá),胞漿染色淡;6h后,NF-κB 不僅在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)增強(qiáng),而且轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),發(fā)生核轉(zhuǎn)移,謂之陽(yáng)性細(xì)胞(P<0.05),在12h 時(shí)達(dá)高峰,細(xì)胞核著色明顯,陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增多(P<0.01);而到18h 時(shí),NF-κB 核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象開(kāi)始減弱(P>0.05)。

        2.3 NF-κB 表達(dá)的Western-blot 法檢測(cè)

        Western 印跡雜交結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果基本一致。在對(duì)照組細(xì)胞的核蛋白提取液中,基本沒(méi)有NF-κB 的表達(dá);1.0mmol/L Hcy+4 μmol/L Cu-SO4刺激細(xì)胞6h 出現(xiàn)核蛋白提取液中NF-κB 的表達(dá),12h 時(shí)達(dá)高峰,到18h 時(shí)表達(dá)減少。

        2.4 Bax 及Bcl-2 mRNA 的表達(dá)

        Hcy 作用后0~18h,細(xì)胞Bcl-2 mRNA 水平逐步降低,而Bax mRNA 水平逐步升高。二者的比值呈下降趨勢(shì)(見(jiàn)圖1~圖4)。

        圖1 不同時(shí)間點(diǎn)Bcl-2 與β-actin 的mRNA 比值

        圖3 不同時(shí)間點(diǎn)Bax 與β-actin 的mRNA 比值

        圖4 不同時(shí)間點(diǎn)Bax 的mRNA 表達(dá)

        3 討論

        細(xì)胞凋亡是一個(gè)極其復(fù)雜、精密的過(guò)程,涉及到許多事件的發(fā)生,包括凋亡相關(guān)基因表達(dá)的升高或下調(diào)等。已證實(shí),細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要通過(guò)兩條途徑產(chǎn)生:即線粒體凋亡途徑和死亡受體(Fas-FasL)介導(dǎo)的途徑[3]。在病理?xiàng)l件下,Hcy 攻擊的主要靶細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞,它可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,是發(fā)生動(dòng)脈硬化的始動(dòng)部位。有研究認(rèn)為,Hcy可以通過(guò)多方面的作用引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Austin認(rèn)為Hcy 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡主要有兩個(gè)途徑[4]:其一為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;此外,胱冬酶-3(caspase-3)的激活是Hcy 引起細(xì)胞凋亡的另一機(jī)制。Hcy 能造成細(xì)胞內(nèi)ROS 增加,使線粒體失去正常的跨膜電位,導(dǎo)致細(xì)胞色素C(cytochrome-c)的釋放,進(jìn)而激活caspase9、6、3,最后出現(xiàn)核蛋白降解,DNA 斷裂,細(xì)胞死亡[5]。Kerkeni 發(fā)現(xiàn),Hcy 的衍生物同型半胱氨酸硫內(nèi)酯(homocysteine thiolactone),通過(guò)激活caspase-3 使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)細(xì)胞DNA 斷裂,細(xì)胞死亡[6]。在這一病理過(guò)程中,caspase-3 和線粒體細(xì)胞色素C 的活性和釋放均明顯增加[7]。在caspase-3 和線粒體細(xì)胞色素C 介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)變孔(permeablity transition pore,PTP)的開(kāi)放和關(guān)閉是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵[8]。而Bcl-2 家族成員對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控主要是通過(guò)調(diào)控線粒體的PTP 的開(kāi)放和關(guān)閉來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其中Bcl-2 和Bax 是一對(duì)正負(fù)凋亡調(diào)節(jié)基因,Bcl-2可抑制PTP 的開(kāi)放從而抑制凋亡因子的釋放和阻止凋亡的發(fā)生,而Bax,Bad,Bak 等作用恰恰相反,它們促進(jìn)PTP 開(kāi)放,從而促進(jìn)凋亡因子釋放。細(xì)胞中的Bax 蛋白可自身形成同源二聚體,并易與Bcl-2蛋白形成異源二聚體復(fù)合物,從而使Bax 失活。Bcl-2 表達(dá)相對(duì)增多時(shí),Bcl-2/Bax 二聚體增多,消除Bax 的促凋亡效應(yīng),而Bax 表達(dá)相對(duì)增多時(shí)Bax/Bax同源二聚體增加,促凋亡作用上調(diào)。Duan[9]用不同濃度的Hcy 干預(yù)HUVEC 24h,發(fā)現(xiàn)Hcy 可以上調(diào)Bax 的表達(dá),下調(diào)Bcl-2 的表達(dá);Tyagi[5]培養(yǎng)鼠心微血管內(nèi)皮細(xì)胞,通過(guò)cDNA 芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Hcy 使mRNA 水平的Bcl-2/Bax 比值下降,激活caspase9、3,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。

        我們的研究發(fā)現(xiàn),Hcy 對(duì)BMVECs 的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,可以造成細(xì)胞死亡。并且干預(yù)組BMVECs 的Bcl-2 mRNA 于處理后0~18h 呈持續(xù)降低趨勢(shì),而Bax mRNA 基本呈增高趨勢(shì),Bcl-2/Bax比值降低。此結(jié)果提示,Hcy 可能通過(guò)抑制Bcl-2 基因表達(dá),促進(jìn)Bax 基因表達(dá),使Bcl-2/Bax 比值降低,致使細(xì)胞凋亡和存活信息平衡失調(diào),從而最終誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡??梢?jiàn)Bcl-2 和Bax 基因在Hcy 誘導(dǎo)BMVECs 細(xì)胞凋亡過(guò)程中同樣起著重要的作用。

        Bcl-2 和Bax 基因的表達(dá)受核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及JNK 等途徑的調(diào)控。有人[4,10,11]在觀察Hcy 對(duì)平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),Hcy 可以激活NF-κB,促進(jìn)NF-κB 的核轉(zhuǎn)位。用超氧負(fù)離子清除劑或I-κB 抑制劑可抑制Hcy 誘導(dǎo)的IKK 激活和NF-κB 激活[12]。我們?cè)诘鞍踪|(zhì)水平上檢測(cè)到,Hcy干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的NF-κB 的的表達(dá),結(jié)果證實(shí)有NF-κB 核轉(zhuǎn)位的變化:6h,NFκB 已經(jīng)出現(xiàn)胞核內(nèi)表達(dá);12h 時(shí)達(dá)高峰,細(xì)胞核著色明顯;18h 時(shí),這一現(xiàn)象開(kāi)始減弱。已知NF-κB 是能調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達(dá)的一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,它在相當(dāng)廣泛的病理生理過(guò)程中起調(diào)控作用,其中包括細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。現(xiàn)有的部分實(shí)驗(yàn)研究表明,NF-κB 激活能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡,而另一些研究中則發(fā)現(xiàn),NF-κB 能促進(jìn)凋亡基因的表達(dá)??梢?jiàn)NF-κB 的激活在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用是多層次多方面的,這可能與研究細(xì)胞的種類及所處應(yīng)激環(huán)境不同有關(guān)。本研究中觀察到,隨著NF-κB 的激活,Bcl-2 mRNA 于處理后0-18 h 呈持續(xù)降低趨勢(shì),而Bax mRNA 轉(zhuǎn)錄水平呈增高趨勢(shì),提示在Hcy 致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的過(guò)程中,NF-κB 有可能參與了Bc1-2 和Bax 基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。

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