張 寧，劉 元

近年來，探討炎癥反應在缺血性腦梗死中的損傷機制成為研究的熱點，抗炎治療被認為是改善腦梗死病情，降低腦卒中患者致殘致死率的有前景的治療方法之一。過氧化物酶體增殖激活型受體γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPARγ)屬于Ⅱ型核受體超家族成員，受配體激活后能調控多種基因的轉錄和表達，除降低血糖水平外，尚可改善動脈粥樣硬化、糾正血脂紊亂、抗臟器纖維化等，新近［1～3］研究發(fā)現(xiàn)PPARγ 選擇性激動劑噻唑烷二酮類藥物(TZDs)參與多臟器缺血再灌注后炎癥反應過程，但其機制尚未清楚。據(jù)此，本實驗采用TZDs 類藥物馬來酸羅格列酮(RSG)對大鼠缺血再灌注后進行藥物干預，觀察各組大鼠腦梗死體積及炎癥因子白介素-18(IL-18)表達變化，試圖為腦卒中抗炎治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 250～280g 清潔級健康雄性成年SD 大鼠60 只(湘雅醫(yī)學院動物實驗中心提供)，隨機分為5 組:假手術組(n=12)，缺血再灌注模型組(n=12)，羅格列酮0.5mg/kg、2mg/kg、5mg/kg 大中小3 種劑量干預組(3 組各n=12)。Longa 線栓法制備大腦中動脈栓塞模型(MCAO)。羅格列酮干預組于缺血即刻及缺血2h 后經(jīng)插入胃管分別灌入馬來酸羅格列酮0.5mg/kg、2mg/kg、5mg/kg 大中小3 種劑量。假手術組和模型組以相同體積的生理鹽水灌胃，在缺血2h 再灌注24h 后處死大鼠。

1.1.2 主要實驗藥品 羅格列酮(rosiglitazone)購自葛蘭素史克公司，IL-18 抗體購買自美國Millipore 公司，PV6001 二抗試劑盒、DAB 顯色試劑盒，由北京中杉金橋生物公司提供，其余試劑由湘雅醫(yī)院神經(jīng)內科實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血再灌注動物模型制備及評分參考Longa 的線栓法制備局灶性大腦中動脈腦缺血模型。主要步驟包括:10%水合氯醛(0.35ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分離頸總動脈、頸外動脈后分別予以結扎，頸總動脈遠端作血管切口，沿頸總和頸內動脈緩慢插入頭端鈍化的尼龍栓線約18±5mm 阻塞大腦中動脈入口，缺血2h 后拔出栓線進行24h 再灌注。假手術組插線深度為8～10mm，其余同模型制備。根據(jù)Longa 的5 級標準評分法對大鼠進行評分并記錄，其中1～3 分為造模成功。沒有神經(jīng)功能缺損、有呼吸困難、提前死亡及處死時發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血的動物均排除。手術中出血過多的動物也棄去。對于實驗中死亡或者剔除的大鼠嚴格按實驗條件統(tǒng)一補充。將制作成功的模型麻醉后4%多聚甲醛進行灌注，取自額極起4～11mm 之間的腦組織4%多聚甲醛固定過夜，依次脫水、透明、浸蠟、包埋。將包埋好的石蠟組織塊修材，自大腦向后以冠狀切面連續(xù)切片，每片厚5μm，收集含缺血區(qū)的腦片貼片、烤片。

1.2.2 IL-18 免疫組化染色檢測 用兔抗大鼠IL-18 多克隆抗體進行免疫組織化學染色，每只實驗動物每個指標取兩張切片。(1)石蠟切片脫蠟:石蠟切片置60 ℃烤箱烤片15h 以上→從烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ10min→二甲苯Ⅱ10min→無水乙醇2min→95%乙醇2min→80%乙醇→70%乙醇→自來水洗。(2)3%H2O2阻斷20min(以消除內源性過氧化物酶的活性，降低背景);PBS 洗3 次，每次3min。(3)抗原修復(檸檬酸pH 6.0 修復10min);PBS 洗3 次，每次3min。(4)滴加5%正常山羊血清封閉，37℃，10～20min(消除背景非特異性著色)。(5)吸干組織周圍多余的血清，不洗，滴加第一抗體，37℃孵育30min 再4℃冰箱過夜;PBS 洗3 次，每次3min。(6)擦干組織周圍PBS，滴加生物素標記的第二抗體，37℃孵育20min，PBS 洗3 次，每次3min。(7)擦干組織周圍PBS，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，37℃孵育20min。(8)PBS洗3 次，每次3min，蒸餾水洗2 次，DAB 顯色(DAB必須現(xiàn)用現(xiàn)配)，鏡下控制顯色程度，顯色約5min，自來水沖洗，蘇木素復染胞核30s，烤干，中性樹膠封片。在生物學顯微鏡下觀察腦缺血側皮質IL-18陽性細胞，在40×10 倍顯微鏡下隨機選取10 個視野，圖像分析軟件(Image-proplus-6，美國)分析計算每張切片中所選中區(qū)域平均光密度值(AOD)。

1.2.3 病理學觀察 石蠟切片HE 染色后光鏡下觀察腦組織缺血半暗帶神經(jīng)元細胞病理學改變及周圍炎性細胞浸潤。

1.2.4 TTC 染色法測定腦梗死體積 每組取6 只麻醉處死后取腦放于零下20℃冰箱中冷凍30min 后，切成1.2mm 厚的腦片，迅速放于2%紅四氮唑(TTC)磷酸緩沖液中，避光37℃恒溫孵育30min。正常組織染為紅色，梗死組織為白色。10%的多聚甲醛溶液中固定24h 后拍照，應用病理圖形分析儀測量腦梗死體積。根據(jù)公式V=t(A1+...An)－(A1+An)t/2 算出腦梗死體積和所染部分體積(其中t 為切片厚度，A 為梗死面積)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 神經(jīng)缺陷評分

動物麻醉后約2～3 h 清醒，假手術組動物清醒后無明顯神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損的癥狀和體征。其他各組動物于清醒后出現(xiàn)反應欠佳，活動量及進食明顯減少，左側前肢無力，提起尾時左前肢屈曲不能伸直，行走時左側偏斜或旋轉跌倒現(xiàn)象。與缺血再灌注模型組比較，大中劑量ROSI 治療組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均明顯降低，差異統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見表1)。

2.2 羅格列酮對大鼠腦梗死體積的影響

缺血再灌注后，假手術組大鼠腦組織未見梗死灶，模型組大鼠右側額頂葉和紋狀體可見較明顯的蒼白梗死灶。與假手術組相比，大中劑量組均可降低腦梗死體積P＜0.05，有統(tǒng)計學意義(見表2)。

2.3 腦缺血再灌注后缺血半暗帶IL-18 表達

IL-18 在神經(jīng)元細胞及膠質細胞均有表達，光鏡下可見棕黃色顆粒沉積于細胞胞漿。假手術組檢測到極少量IL-18 陽性表達細胞。與假手術組相比，模型組及小劑量干預組陽性蛋白表達數(shù)量明顯增加，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01);與模型組相比，大中劑量干預組病灶處陽性表達數(shù)量明顯減少，有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)(見表3、圖1)。

2.4 病理組織學觀察

光學顯微鏡下觀察到假手術組腦組織HE 染色顯示結構正常。模型組表現(xiàn)出典型腦梗死改變:梗死區(qū)域神經(jīng)元細胞數(shù)量較少，細胞核破裂分解、固縮壞死，細胞形態(tài)腫脹不規(guī)則，伴有白細胞浸潤。與模型組相比，ROSI 大中劑量治療組壞死灶相對較小，高倍鏡下可以觀察到腫脹壞死的細胞，但細胞減少程度較輕，壞死灶邊緣炎性細胞浸潤較少。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分的比較(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分的比較(±s)

與模型組比較* P＜0.05

表2 各組大鼠缺血再灌注后腦梗死體積(mm3)

表3 各組大鼠缺血側頂葉皮質IL-18 表達的比較(±s)

表3 各組大鼠缺血側頂葉皮質IL-18 表達的比較(±s)

與假手術組比較▲P＜0.05;與模型組比較* P＜0.05

圖1 各組大鼠缺血側頂葉皮質IL-18 表達(IL-18×400)

3 討論

缺血再灌注引起的腦損傷機制包括多種因素，十分復雜，目前認為其病理生理機制包括缺血后的代謝異常、能量耗竭與酸中毒、興奮性氨基酸毒性、細胞內鈣離子超載、炎癥細胞因子損害、氧自由基損害、即早基因、熱休克蛋白基因表達以及缺血后遲發(fā)性神經(jīng)細胞凋亡等。其中，缺血再灌注后腦組織內過度的炎癥反應是造成再灌注損傷的重要機制之一，而表達增加的炎癥因子更被認為是腦缺血再灌注損傷發(fā)病機制中的關鍵介質［4］。因此有效阻斷炎癥反應是治療缺血性腦血管疾病的一個重要策略。

炎癥反應在腦缺血再灌注引起的繼發(fā)性損害中起著重要作用.再灌注時各種炎性因子激活炎性細胞，同時參與了神經(jīng)細胞的凋亡和壞死，在炎癥級聯(lián)反應中起關鍵作用。IL-18 是近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學特性的細胞炎性因子。屬于IL-1 細胞因子家族成員，主要由單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞分泌，IL-18 具有多種生物學功能，能抑制保護因子IL-4和IL-10 的產(chǎn)生。上調細胞間黏附分子(ICAM)的表達，促進炎性細胞的粘附和聚集，參與神經(jīng)元細胞損傷。

還能促進致炎因子的釋放，特別是具有誘導產(chǎn)生IFN-γ 的強大功能，增強Th1 型細胞反應。此外，IL-18 還可以刺激T 細胞產(chǎn)生IL-2、GM-SF、和TNFα。外周血單核細胞在IL-18 刺激24h 后，可檢測到有IL-1 和IL-8 的產(chǎn)生，與Th1 型細胞反應密切相關。有研究顯示，IL-18 與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關，參與了腎臟、胃腸道缺血再灌注損傷［5，6］。國內也有研究表明急性腦梗死患者血清IL-18 水平升高;血清IL-18 水平與腦梗死體積及臨床神經(jīng)功能缺損程度密切相關［7］。本研究證實，模型組缺血區(qū)腦組織IL-18 表達明顯增加，且壞死處白細胞浸潤明顯增多，表明炎癥反應明顯參與腦梗死損傷的病理生理過程，進一步印證了IL-18 及其介導的炎性細胞浸潤和炎癥反應參與缺血/再灌注腦損傷過程。

作為核轉錄因子，PPARγ 主要通過調節(jié)細胞中目的基因轉錄而發(fā)揮其功能。羅格列酮作為PPARγ 的特異性激動劑，其抗炎作用逐漸引起了人們的重視。動物缺血實驗顯示，PPARγ 經(jīng)配體激活后可以抑制缺血導致的TNF-α、IL-1β、6、8 等細胞因子過表達，減輕白細胞在缺血區(qū)的浸潤，降低炎性細胞的毒性作用［8］。國外有研究表明，缺血再灌注后，ROSI 激活PPARγ 可以抑制IL-、TNF-α、IL-6 等誘導的IL-18 表達增加，還可以通過抑制caspase-1阻斷IL-18 的激活。此外，IL-18 誘導產(chǎn)生大量的IFN-γ 是其主要生物學功能之一，PPARγ 激活后可以降低IFN-γ 的生物功能，使IFN-γ 激活的單核/巨噬細胞、淋巴細胞仍表現(xiàn)出靜止期的功能，并抑制iNO2mRNA、基質金屬蛋白酶等炎性介質mRNA 的表達［9，10］我們實驗結果也表明，與模型組比較，PPARγ 選擇性激動劑羅格列酮2mg/kg、5mg/kg 可明顯改善神經(jīng)缺陷評分、梗死處組織病理學損傷，明顯縮小缺血再灌注后腦梗死體積，表明羅格列酮對再灌注后神經(jīng)損傷具有保護作用，與文獻報道的其它噻唑烷二酮類藥物效應相似［11］。應用羅格列酮可明顯降低炎癥分子IL-18 表達和炎性細胞浸潤，在大中劑量組表現(xiàn)更顯著，而小劑量組未見明顯差異，這表明羅格列酮對缺血再灌注腦損傷的保護作用可能與其抑制IL-18 的抗炎效應有關，且可能具有劑量依賴性。

羅格列酮對缺血再灌注損傷的保護作用已引起越來越多的重視，我們的實驗顯示了羅格列酮能夠減少腦梗死面積，改善預后，且其保護作用與抑制炎性介質作用，減少炎性細胞的浸潤有關。需要指出的是，缺血再灌注損傷是一個十分復雜的病理生理過程，其機制往往是多方面的，因此，羅格列酮的保護作用可能與其他如抗凋亡、改善缺血后能量代謝、抗自由基、拮抗血小板活化因子、抗興奮性毒性等藥理作用相關聯(lián)，有關羅格列酮抗腦缺血再灌注損傷的確切分子作用機制正在進一步研究中。

［1］Nakajima A，Wada K，Mik H，et al.Endogenous PPARγmediates antiinflammatory activity in marine ischemia perfusion injury［J］.Gastroenterology，2001，120:460－469.

［2］Okada M，Yan SF，Pinsky DJ.PPARγ activation suppresses ischemic Induction of Egrl and its inflammatory gene targets targets［J］.FASEBJ，2002，16:1861－1868.

［3］Wayman NS，Attori Y，McDonald M，et al.Ligands of the PPAγreduce myocardial infarct size［J］.FASEBJ，2002，16:1027－1040.

［4］Terao S，Yilmaz G，Stokes KY，et al.Inflammatory and injury responses to ischemic stroke in obese mice［J］.Stroke，2008，39(3):943－950.

［5］Wu H，Craft ML，Wang P，et al.IL-18 contributes to renal damage after ischemia-reperfusion［J］.J Am Soc Nephrol，2008，19(12):2331－2341.

［6］Yang YJ，Shen Y，Chen SH，et al.Role of interleukin 18 in acute lung inflammation induced by gut ischemia reperfusion［J］.World J Gastroenterol，2005，11(29):4524－4529.

［7］魏 芳，湯永紅，劉卓然.急性腦梗死患者血清白細胞介素-18水平及臨床意義［J］.南華大學學報醫(yī)學版，2007，35(5):719－723.

［8］LuoY，Yin W，Signore AP，et al.Neuroprotection against focal ischemic brain injury by the PPARγagonist rosiglitazone［J］.Neurochem，2006，97(2):435－448.

［9］Padilla J，Kaur K，Cao HJ，et al.Peroxisomel proliferator activator receptor-gamma agonists and 15-deoxy-Delta12，14-PGJ2 induce apoptosis in normal and malignant B-lineage cells［J］.JImmuno，2000，16(5):6941－6948.

［10］Harris SG，Phipps RP.The nuclear receptor PPARgamma is expressed by mouse Tlymphocyte and PPARgamma agonists induce apotosis［J］.EurJImmunol，2001，31(2):1098－1105.

［11］Shimazu T，Inoue I，Araki N，et al.PPARγagonist reduces infarct size in transient but not in permanent ischemia［J］.Stroke，2005，36(2):353－359.