郭 津，李曉捷，姜志梅，張麗華，龐 偉，呂智海，王魯川，張明達(dá)

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)屬G 蛋白偶聯(lián)受體C 家族成員，具有氨基胞外域(ECD)、7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)組成的中心區(qū)(TMD s)和胞內(nèi)羧基末端(COOH)［1，2］。1993 年，CaSR 首先發(fā)現(xiàn)于牛甲狀旁腺，CaSR 不僅在維持機(jī)體Ca2+和其它金屬離子穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵作用，而且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、基因表達(dá)、離子通道開放等［3～6］。本實(shí)驗(yàn)觀察戊四氮誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作模型中的CaSR 表達(dá)規(guī)律，及氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在癲癇發(fā)作中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 戊四氮(pentetrazole PTZ 美國sigma 公司);髓過氧化物酶(MPO)試劑盒和黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所);TUNEL 檢測試劑盒(羅氏公司)Beckman DU640 紫外分光光度計(jì)H-600 型;紫外凝膠檢測和成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

1.2 大鼠癲癇發(fā)作模型的復(fù)制 Wistar 大鼠，雌雄各半，體重200±20g，由佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用大鼠腹腔注射PTZ［35mg/(kg·d)］，連續(xù)28d，制備大鼠癲癇模型。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 動物隨機(jī)分為2 組(每組n=12):對照組(control group)，癲癇組(epilepsy group)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 XOD、MPO 的含量測定 大鼠麻醉后，眼球取血2ml，待血液凝固后，3000r/min 4℃離心10min，取上層血清，嚴(yán)格按試劑盒說明操作，分別測定XOD、MPO 的含量。

1.4.2 海馬組織尼氏染色的光鏡觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從大鼠海馬部切取的1mm×1mm×1mm 腦組織，用4%多聚甲醛磷酸緩沖溶液固定24～48h。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、染色、透明和封片，制成尼氏普通的染色切片，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4.3 CaSR、Bax、Bcl-2 和caspase-3 蛋白表達(dá)的檢測 海馬組織放入研缽中，低溫研磨后，加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟(Phenyl methane sulfonyl fluoride PMSF)，冰上放置40min，4℃下12000r/min離心40min，取上清。以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)，用Bradford 法對上清進(jìn)行蛋白定量。取20μg 蛋白樣品，10%SDS-PAGE 電泳，100V 轉(zhuǎn)移1h 至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37℃封閉1h;抗分別為anti-CaSR(1∶3000)、anti-Bax(1∶500)、anti-Bcl-2(1∶500)、anti-caspase-3(1∶500)，4℃過夜。同時(shí)，另1 張用不含抗體TBS-T 液孵育，作為陰性對照。反復(fù)洗膜后，將膜與堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗IgG 抗體(1∶1000)孵育，室溫輕搖1h，洗膜后，用Western blotting印跡觀察，用圖像分析測定各帶吸光度(A)值做定量分析。

1.4.4 TUNEL 染色 切片常規(guī)脫蠟脫水，20μl 蛋白酶K 室溫孵育15～30min，消化組織蛋白3% H2O2溶液浸泡10min，滅活內(nèi)源性酶，滴加50μl TUNEL 反應(yīng)混合液，37℃孵育60min，50μl POD 標(biāo)記的抗熒光素抗體滴于玻片，37℃孵育30min，DAB顯色20min 蘇木素復(fù)染，PBS 沖洗，脫水、透明、封片。光鏡下正常海馬神經(jīng)元核染成藍(lán)色(TUNEL 陰性)，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色(TUNEL 陽性)。每張切片隨機(jī)取5 個(gè)以上高倍視野，計(jì)數(shù)不少于500 個(gè)海馬神經(jīng)元，計(jì)算凋亡率。公式如下:凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)/500)×100%。

2 結(jié)果

2.1 XOD 和MPO 的含量變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測定大鼠XOD 和MPO 的含量，檢測結(jié)果癲癇組明顯高于正常組(P＜0.01 vs contro l)(見表1)。

表1 XOD 和MPO 的含量變化

2.2 海馬組織的形態(tài)學(xué)變化 對照組皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，邊緣清晰，胞漿淡染，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富。癲癇組細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹、破裂、輪廓模糊、排列紊亂、細(xì)胞間距加大，胞漿內(nèi)尼氏小體減少。對照組神經(jīng)元數(shù)目為102.56±11.37，癲癇組神經(jīng)元數(shù)目為36.62±4.09，對照組與癲癇組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(見圖1)。

圖1 光鏡下海馬組織尼氏染色的觀察(×40 倍)

2.3 大鼠海馬組織CaSR 蛋白表達(dá)情況 大鼠CaSR 的蛋白表達(dá)，癲癇組明顯高于正常組(P＜0.05 vs control)(見圖2)。

2.4 大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)情況 大鼠Bax 的蛋白表達(dá)，癲癇組明顯高于正常組(P＜0.05)(見圖3)。大鼠Bcl-2 的蛋白表達(dá)，癲癇組明顯低于正常組(P＜0.05)(見圖4)。大鼠caspase-3 的蛋白表達(dá)，癲癇組明顯高于正常組(P＜0.05)(見圖5)。

圖2 不同組別海馬組織中CaSR 蛋白的表達(dá)(* P＜0.05 vs control)

圖3 不同組別海馬組織中Bax 蛋白的表達(dá)(* P＜0.05 vs control)

圖4 不同組別海馬組織中Bcl-2 蛋白的表達(dá)(* P＜0.05 vs control)

圖5 不同組別海馬組織中caspase3 蛋白的表達(dá)(* P＜0.05 vs control)

2.5 大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡變化 在大鼠神經(jīng)細(xì)胞TUNEL 染色中，細(xì)胞核呈棕色為凋亡陽性細(xì)胞，細(xì)胞核呈藍(lán)色則為非凋亡的陰性細(xì)胞。結(jié)果表明:與對照組相比，癲癇組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多(見圖6)。

圖6 大鼠海馬組織TUNEL 染色結(jié)果(* P＜0.05 vs control)

3 討論

癲癇是一種常見的以反復(fù)突然發(fā)作的意識喪失伴抽搐為主要癥狀的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全世界有超過五千萬的癲癇患者［7，8］。但由于對癲癇認(rèn)識的局限性，癲癇的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚［9～11］。點(diǎn)燃模型為目前應(yīng)用最廣泛的癲癇模型，特別是其發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與人類癲癇的發(fā)病機(jī)制相似。PTZ 點(diǎn)燃不僅可進(jìn)行性提高發(fā)作易感性，還可引起腦功能改變，現(xiàn)被公認(rèn)為難治性癲癇的理想模型。鑒此，本實(shí)驗(yàn)采用連續(xù)腹腔注射PTZ 的方法復(fù)制癲癇模型。結(jié)果顯示:模型組有連續(xù)多次的Ⅲ～Ⅴ級癲癇發(fā)作，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)可以認(rèn)為實(shí)驗(yàn)動物均達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，癲癇模型制備成功。

采用Western blotting 技術(shù)，本文觀察到模型組腦組織CaSR 蛋白表達(dá)明顯增多，它提示腦組織CaSR 的表達(dá)增加參與了癲癇的發(fā)生。我們在癲癇的海馬神經(jīng)元模型中，運(yùn)用CaSR 激動劑和阻斷劑，進(jìn)一步證實(shí)CaSR 的表達(dá)增加通過激活凋亡信號通路促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡的發(fā)生(另文發(fā)表)。本文還觀察到模型組血清中XOD 和MPO 含量升高，這表明氧化應(yīng)激是癲癇所致腦損傷的內(nèi)在機(jī)制之一。我們前期研究已證明，細(xì)胞外鈣增加及其它CaSR激動劑(Gd3+、精胺等)可通過G 蛋白PLC-IP3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣增多，發(fā)生細(xì)胞內(nèi)鈣超載。

眾多實(shí)驗(yàn)表明，Bcl-2 家族促凋亡成員(如Bax、Bak 和tB id 等)在凋亡因素刺激下可轉(zhuǎn)位到線粒體外膜形成孔道，而抑凋亡成員(如Bcl-2、Bcl-xl)則可阻止之。因此，抑凋亡與促凋亡成員之間的平衡將決定細(xì)胞生存或凋亡。一般認(rèn)為，過度的Ca2+內(nèi)流在癲癇的發(fā)生上起著重要的作用，尤其是引起細(xì)胞凋亡和壞死。在我們的實(shí)驗(yàn)中，HE 染色、TUNEL 染色觀察均證明，PTZ 所致大鼠癲癇模型發(fā)生了明顯的海馬神經(jīng)元凋亡或壞死。本實(shí)驗(yàn)還觀察到:模型組caspase-3 活化后形成的17×103的多肽片段及Bax 的表達(dá)明顯高于對照組，Bcl-2 的表達(dá)明顯低于對照組?？梢?，模型組細(xì)胞凋亡的發(fā)生，顯然與抑凋亡成員與促凋亡成員之間的失衡有關(guān)［12］。

綜上，PTZ 復(fù)制癲癇發(fā)作模型可引起大鼠腦組織CaSR 表達(dá)增加和細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可能也參與了癲癇的發(fā)作。

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