楊海玉，劉 勇

慢性酒精中毒對于人類健康的危害日趨嚴(yán)重。大腦是酒精誘導(dǎo)損傷的最常見靶器官之一，長期大量飲酒可引起腦器質(zhì)性損害，并逐漸發(fā)展至癡呆狀態(tài)，臨床稱之為酒精性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)［1］。由于其治療手段有限且治療效果不佳，大多數(shù)AAD 患者不能完全恢復(fù)至正常。酒精屬親脂性小分子化學(xué)物質(zhì)，可迅速通過血腦屏障和細(xì)胞膜，對腦組織造成直接損害。目前研究發(fā)現(xiàn)，短暫酒精暴露即可產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，引起神經(jīng)元大量死亡;而長期酒精接觸可顯著抑制神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及降低細(xì)胞存活率，導(dǎo)致神經(jīng)元分化延緩以及結(jié)構(gòu)破壞［2，3］。但是，關(guān)于這方面的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。由于取材受到來源以及倫理學(xué)的限制，使用人原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞作為研究對象困難很大。SH-SY5Y 細(xì)胞又稱為人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，該細(xì)胞誘導(dǎo)分化后可表現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)特征，目前常用于神經(jīng)元損傷模型的研究［4，5］，具有取材培養(yǎng)方便、易行等優(yōu)勢。因此，在本研究中我們采用維甲酸(retinoic acid，RA)誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞分化，并通過給予不同濃度的酒精連續(xù)培養(yǎng)，觀察酒精對SH-SY5Y 細(xì)胞的損傷作用，為進(jìn)一步研究AAD 的發(fā)病機(jī)制提供簡單可行的體外研究模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司;胎牛血清購自美國Hyclone 公司;RA、四甲基偶氮唑藍(lán)［3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］、碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自美國Sigma 公司。

1.2 SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化［6］

SH-SY5Y 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)采用DMEM 高糖培養(yǎng)基加入體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，5%CO2、37℃條件培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%～90%融合時(shí)，用體積分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將細(xì)胞按1×104濃度平均接種到96 孔板，待細(xì)胞長至60%～70%融合時(shí)，換用含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并加入終濃度為10μm 的RA 誘導(dǎo)細(xì)胞分化，每天換液一次，連續(xù)6d，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 檢測酒精對SH-SY5Y 細(xì)胞增殖的影響

本研究采用MTT 比色法檢測酒精對SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響。該細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，于7d 棄去含RA 的培養(yǎng)基，酒精組細(xì)胞分別加入含不同濃度酒精(10～400mol/L)的培養(yǎng)基，對照組細(xì)胞加入不含酒精的培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h。之后，每孔加入20μl MTT 溶液(5mg/ml)，37 ℃培養(yǎng)4h。棄去所有溶液后加入200μl DMSO 溶液，振蕩10min，采用酶標(biāo)儀570nm 波長檢測光密度(optical density，OD)值，并根據(jù)各組OD 值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 檢測酒精對SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響

PI 是一種能穿過破損細(xì)胞膜且與DNA 結(jié)合的熒光染料，散發(fā)紅色熒光，常用于細(xì)胞凋亡檢測。酒精組細(xì)胞給予酒精(100mol/L)作用24h 后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗3 次，然后每孔滴加適量PI 染色液覆蓋細(xì)胞，避光染色10min，PBS 洗3 次后采用熒光顯微鏡(型號DM3000，德國徠卡公司)觀察取圖。對照組給予PBS 代替酒精，其余處理同酒精組。凋亡細(xì)胞的特征表現(xiàn)為細(xì)胞核呈明顯固縮、濃染。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SH-SY5Y 細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的形態(tài)觀察

如圖1 所示，未分化的SH-SY5Y 細(xì)胞呈長梭形，貼壁生長良好(見圖1A);而在使用RA 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞胞體增大，有較多細(xì)長的突起，表現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)特征(見圖1B)。

2.2 酒精對SH-SY5Y 細(xì)胞增殖的影響

分化后的SH-SY5Y 細(xì)胞經(jīng)不同濃度酒精作用24 h，采用MTT 法檢測細(xì)胞增殖變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酒精濃度達(dá)到100 mol/L 時(shí)，與對照組相比，細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P＜0.05);并且隨著酒精濃度的增加(100～400mol/L)，細(xì)胞增殖抑制呈濃度依賴關(guān)系(見圖2)。

圖1 SH-SY5Y 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

圖2 MTT 法檢測不同濃度酒精對SH-SY5Y 細(xì)胞增殖的作用

2.3 酒精對SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡的影響

如圖3 所示，酒精組(100mol/L)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯，可見大量細(xì)胞表現(xiàn)胞核皺縮、濃染(PI 染色陽性)(見圖3B)，而對照組則少見凋亡細(xì)胞存在(見圖3A)。

圖3 PI 染色檢測酒精誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

AAD 是慢性酒精中毒最為嚴(yán)重的精神病狀態(tài)，也是長期大量飲酒引起腦器質(zhì)性損害的結(jié)果，臨床表現(xiàn)記憶力缺損伴其他認(rèn)知功能障礙為其主要特征。研究結(jié)果顯示慢性酒精中毒已成為誘導(dǎo)癡呆發(fā)病的重要因素，AAD 患者可占癡呆發(fā)病人群的21%～24%［7］。目前研究表明慢性酒精中毒導(dǎo)致的腦損害是一個(gè)慢性進(jìn)展性過程，呈不可逆性并伴有多種病理學(xué)改變。研究證實(shí)慢性酒精中毒患者的特定腦區(qū)可出現(xiàn)選擇性神經(jīng)元或神經(jīng)核團(tuán)丟失、神經(jīng)軸突減少以及復(fù)雜性突觸結(jié)構(gòu)退化等病理變化，其機(jī)制與慢性酒精作用促進(jìn)氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎性反應(yīng)、抑制神經(jīng)營養(yǎng)因子和粘附分子表達(dá)、破壞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其功能、影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放以及干擾細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等密切相關(guān)［8～10］。目前有關(guān)酒精與癡呆發(fā)生的關(guān)系及其具體分子機(jī)制仍不十分清楚，因此建立簡便易行的酒精性癡呆體外研究模型將有助于深入探討這類疾病的發(fā)病機(jī)制。

SH-SY5Y 細(xì)胞具有神經(jīng)元分化潛能，是目前公認(rèn)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的細(xì)胞模型。本課題以SH-SY5Y 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，以RA 為誘導(dǎo)劑，通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化，進(jìn)一步觀察酒精對該細(xì)胞的損傷作用。MTT 檢測證實(shí)酒精對SH-SY5Y 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并且呈濃度依賴性。另外通過PI 染色法進(jìn)一步觀察證實(shí)，酒精可誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡。以上結(jié)果提示SH-SY5Y 細(xì)胞對酒精誘導(dǎo)損傷敏感，可用于建立研究AAD 發(fā)病機(jī)制的體外模型。

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