楊海玉，吳曉牧，劉 勇，曾玉娥

慢性酒精中毒對(duì)于人類(lèi)健康的危害日趨嚴(yán)重。酒精性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)是指由于長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致慢性腦器質(zhì)性損害而出現(xiàn)記憶缺損并伴有一種或一種以上認(rèn)知功能受損的精神行為異常，同時(shí)可伴有震顫、譫妄、痙攣發(fā)作等神經(jīng)功能障礙，記憶受損是其最重要和最基本的特征［1］。研究結(jié)果顯示慢性酒精中毒已成為誘導(dǎo)癡呆發(fā)病的重要因素，AAD 患者可占癡呆發(fā)病人群的21%～24%［2］。由于其治療手段有限且治療效果不佳，大多數(shù)AAD 患者不能完全恢復(fù)至正常。因此，深入研究酒精誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能損害的機(jī)制，對(duì)于尋求更為有效的AAD 治療方法具有十分重要的意義。研究認(rèn)為海馬具有特殊的神經(jīng)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是調(diào)控學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)鍵腦區(qū)。目前研究表明酒精誘導(dǎo)海馬損傷的機(jī)制較為復(fù)雜，可從神經(jīng)細(xì)胞、突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)分子等多方面對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能造成損害［3］。本研究通過(guò)建立酒精性癡呆大鼠模型，以大鼠Morris 水迷宮(Morris water maze，MWM)行為學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶功能，并且觀察大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況以及血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，探討其與酒精誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能損害的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 AAD 大鼠模型的建立

采用8 周齡雄性SD 大鼠(180～220g)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。按完全隨機(jī)區(qū)組法將動(dòng)物分為生理鹽水組(n=6)和酒精組(n=8)。酒精組大鼠給予持續(xù)酒精灌胃(20%，8ml/kg)28d，每天1 次。生理鹽水組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2 MWM 行為學(xué)檢測(cè)［4］

檢測(cè)動(dòng)物從入水至尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)，并以此作為衡量動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)規(guī)定大鼠最長(zhǎng)游泳時(shí)間為60s，如動(dòng)物在60s 內(nèi)找不到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)停留20s，記錄該次EL 為60s。所有大鼠在檢測(cè)前均接受訓(xùn)練5d。各組大鼠分別于灌胃前和灌胃28d 后進(jìn)行MWM 行為學(xué)檢測(cè)。每只動(dòng)物以3 次游泳成績(jī)(分別從3 個(gè)入水點(diǎn)記錄)的平均值作為該動(dòng)物的EL。

1.3 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)

各組大鼠于灌胃28d MWM 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后處死取腦。選取大鼠海馬區(qū)進(jìn)行組織切片，經(jīng)脫蠟、水化處理后用PBS 洗3 次，然后每張切片滴加適量Hoechst 33342 染色液(碧云天生物技術(shù)研究所)覆蓋組織，避光染色10min，PBS 洗3 次后封片，采用熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡)20 倍鏡下觀察取圖。每只大鼠各選取1 張切片，每張切片雙側(cè)海馬的海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)和CA1區(qū)分別隨機(jī)選取3個(gè)視野，并進(jìn)行凋亡神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)。凋亡細(xì)胞的特征表現(xiàn)為細(xì)胞核呈明顯固縮、濃染。

1.4 氧化應(yīng)激檢測(cè)

各組大鼠處死前取血清放-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)測(cè)試盒和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)測(cè)試盒(南京建成)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)T-SOD 反應(yīng)液(550nm)和 GSH-Px 反應(yīng)液(412nm)的光密度(opticaldensity，OD)值。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3 次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MWM 檢測(cè)結(jié)果

為了評(píng)價(jià)酒精對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，我們對(duì)各組大鼠進(jìn)行了MWM 行為學(xué)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示建模前兩組大鼠的EL 時(shí)間無(wú)明顯差異(P＞0.05);而大鼠在給予酒精灌胃28d 后，與生理鹽水組相比，其EL 時(shí)間明顯延長(zhǎng)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

2.2 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

如圖1 所示，酒精組大鼠海馬DG 區(qū)可見(jiàn)大量聚集分布的異形、致密濃染凋亡細(xì)胞(見(jiàn)圖1B，Eth)，而生理鹽水組大鼠海馬DG 區(qū)僅見(jiàn)少量濃染凋亡細(xì)胞(見(jiàn)圖1A，Con)。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，酒精組大鼠海馬DG 區(qū)(16.00±0.89 vs.99.5 0±12.39，cells，P＜0.01)和CA1區(qū)(9.50±2.18 vs.35.83±4.45，cells，P＜0.01)中的凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量均明顯增加。

圖1 大鼠海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

2.3 大鼠血清氧化應(yīng)激檢測(cè)結(jié)果

表2 數(shù)據(jù)顯示與生理鹽水組相比，大鼠給予酒精灌胃28d 后，其血清中GSH-Px 的酶活力明顯抑制，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);而T-SOD 的酶活力雖有下降趨勢(shì)，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠MWM 檢測(cè)EL 比較(s)

表2 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果(U/ml)

3 討論

AAD 是慢性酒精中毒最為嚴(yán)重的精神病狀態(tài)，也是長(zhǎng)期大量飲酒引起腦器質(zhì)性損害的結(jié)果，臨床表現(xiàn)記憶力缺損伴其他認(rèn)知功能障礙為其主要特征。本研究通過(guò)持續(xù)酒精灌胃28d 建立AAD 大鼠模型，經(jīng)MWM 行為學(xué)檢測(cè)證實(shí)其EL 時(shí)間顯著延長(zhǎng)，提示酒精對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能造成損傷。研究認(rèn)為海馬是調(diào)控學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)鍵腦區(qū)，在短時(shí)記憶轉(zhuǎn)為長(zhǎng)時(shí)記憶以及空間航行定位功能中具有重要作用。大量研究證實(shí)長(zhǎng)期慢性飲酒可促使海馬體積減小及海馬區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Oliveira-da-Silva 等［5］對(duì)出生后30～45d 的C57BL/6 小鼠給予腹腔注射酒精發(fā)現(xiàn)，酒精作用可導(dǎo)致海馬大部分區(qū)域(包括齒狀回顆粒層及分子層、CA1、CA2和CA3區(qū))的凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，而且神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞密度明顯減少。Vongvatcharanon 等［6］對(duì)3 月齡雌性成年Wistar 大鼠給予低濃度和高濃度酒精作用3w～0.5y發(fā)現(xiàn)，各組大鼠海馬區(qū)和扣帶回皮質(zhì)γ-氨基丁酸能神經(jīng)元減少和神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞增加，并且這種改變隨著飲酒時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。同樣，本研究也證實(shí)了酒精可誘導(dǎo)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡。以上結(jié)果提示酒精促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡是其導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能損傷的重要機(jī)制。

目前研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是酒精誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制。氧化應(yīng)激是指由于體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，活性氧自由基產(chǎn)生過(guò)多而超出機(jī)體清除能力，氧自由基可透過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)層與胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而損傷細(xì)胞膜并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究證實(shí)長(zhǎng)期慢性飲酒可通過(guò)抑制抗氧化酶的活性使細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成過(guò)多，從而造成細(xì)胞損傷［7，8］。GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種過(guò)氧化物分解酶，也是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)之一。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，它能催化GSH 變?yōu)镚SSG，使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的損害。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)也是重要的抗氧化酶之一，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的關(guān)鍵酶。Scolaro 等［9］研究發(fā)現(xiàn)慢性酒精作用可明顯抑制大鼠海馬及血清中GSH-Px 的酶活力，而對(duì)SOD 的酶活力卻有上調(diào)作用。在本研究中，我們同樣證實(shí)酒精可明顯抑制大鼠血清GSH-Px 的酶活力，但對(duì)T-SOD 的作用不明顯，提示酒精對(duì)機(jī)體抗氧化能力的損傷主要與抑制GSH-Px 功能有關(guān)。由此，我們認(rèn)為，針對(duì)性阻斷酒精對(duì)GSH-Px 功能的抑制是進(jìn)一步研究酒精性癡呆治療方法的突破口。

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