陳業(yè)剛，楊 拓，劉 鵬，王建民，孫 光

p-mTOR、p-p70S6K蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)

陳業(yè)剛1，楊 拓1，劉 鵬1，王建民1，孫 光2

目的：探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路蛋白（p-mTOR）、核糖體蛋白S6激酶（p-p70S6K）在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系。方法：利用免疫組化染色檢測mTOR通路蛋白p-mTOR、p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)情況，分析p-mTOR、p-p70S6K在不同膀胱組織中的表達(dá)差異，與膀胱癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及與膀胱尿路上皮癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：p-mTOR在膀胱尿路上皮癌中的陽性表達(dá)率（43.3%）高于正常黏膜（17.5%），p-mTOR表達(dá)陽性率隨著腫瘤分級分期的增加相應(yīng)增加，多發(fā)性膀胱尿路上皮癌p-mTOR表達(dá)陽性率（70.5%）高于單發(fā)組（31.4%），復(fù)發(fā)組（70.5%）高于未復(fù)發(fā)組（31.4%，P＜0.01）；p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌陽性率（25.9%）高于正常膀胱黏膜（7.5%，P＜0.05），p-p70S6K表達(dá)陽性率隨著腫瘤分級分期的增加相應(yīng)增加，多發(fā)性膀胱尿路上皮癌p-p70S6K表達(dá)陽性率（45.9%）高于單發(fā)組（17.1%），復(fù)發(fā)組（30.3%）高于未復(fù)發(fā)組（17.4%，P＜0.01）；腫瘤分級、分期、數(shù)目及p-mTOR表達(dá)分別是膀胱腫瘤無瘤生存的獨(dú)立預(yù)后因子。結(jié)論：mTOR/p-mTOR/p-p70S6K通路的激活與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，p-mTOR可以作為預(yù)測膀胱尿路上皮癌復(fù)發(fā)的預(yù)后因子。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；核糖體蛋白S6激酶；膀胱尿路上皮癌；蛋白表達(dá)

PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤的形成和發(fā)展中扮演非常重要的角色,并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)通過研究哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路蛋白p-mTOR、核糖體蛋白S6激酶（p-p70S6K）在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)情況，探討p-mTOR、p-p70S6K在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并且為mTOR抑制劑應(yīng)用于膀胱尿路上皮癌的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2006年1月—2009年1月天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科術(shù)后病理確診為膀胱尿路上皮癌的病例，排除隨訪資料不完整、姑息手術(shù)或者二次手術(shù)的患者，隨機(jī)選取201例，腫瘤分期采用膀胱癌2009年TNM分期系統(tǒng)，分級同時(shí)采用WHO 1973分級法WHO 2004年分級法。患者平均年齡65歲（25～89歲）；男137例，女64例；分期：pT1期94例（46.8%），pT2期46例（22.9%），pT3期37例（18.4%），pT4期24例（11.9%）；分級：G1～2級127例（63.2%），G3級74例（36.8%）。隨訪時(shí)間35個(gè)月（3～45個(gè)月），復(fù)發(fā)81例（40.3%），復(fù)發(fā)時(shí)間8個(gè)月（1～24個(gè)月）。臨床資料見表1。同時(shí)選取40例正常膀胱黏膜組織作為對照。

表1 p-mTOR、p-p70S6K與膀胱尿路上皮癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n,%，n=201)

1.2 方法 免疫組化染色檢測p-mTOR、p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)。PV-9001兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒、濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；抗phospho-mTOR(Ser2448, 49F9)、phosphor-p70S6 kinase(Thr389;1A5)購自Cell Signaling Technology(Beverly,MA,USA)。

石蠟切片常規(guī)脫水脫蠟水化，0.01M、pH6.0枸櫞酸緩沖液高溫高壓修復(fù)抗原，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。對照組用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性乳腺癌組織作為陽性對照。以腫瘤細(xì)胞胞漿、胞核或胞膜上出現(xiàn)棕黃色為陽性。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算這10個(gè)高倍視野陽性細(xì)胞的平均百分比。根據(jù)著色強(qiáng)度和著色細(xì)胞百分率判斷結(jié)果。染色強(qiáng)度：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色或黃褐色為2分，褐色為3分。著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥50%為3分。將著色程度和著色百分率得分乘積，結(jié)果0～5分為低表達(dá)，6～9分為高表達(dá)[1]。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 15.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)和Cox回歸模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-mTOR、p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌和正常膀胱黏膜的表達(dá) p-mTOR主要表達(dá)于胞漿，p-p70S6K主要表達(dá)于胞核（圖1）。40例正常膀胱黏膜組織中，p-mTOR陽性7例，占17.5%，p-p70S6K陽性3例，占7.5%；201例膀胱尿路上皮癌組織中，p-mTOR陽性87例，占43.3%，p-p70S6K陽性52例，占25.9%。p-mTOR、p-p70S6K在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)明顯高于正常膀胱黏膜（P＜0.05）。詳見表2。

圖1 p-mTOR、p-p70S6K在不同膀胱黏膜中的表達(dá)（×200）

表2 p-mTOR和p-p70S6K在膀胱上皮中的表達(dá)（n,%）

2.2 p-mTOR、p-p70S6K表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 p-mTOR與腫瘤分級、分期、是否多發(fā)相關(guān)。隨著腫瘤分級分期的增加，p-mTOR表達(dá)陽性率相應(yīng)增加；多發(fā)性膀胱尿路上皮癌p-mTOR表達(dá)陽性率(70.5%)高于單發(fā)組(31.4%)；復(fù)發(fā)組（70.5%）高于未復(fù)發(fā)組（31.4%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；p-mTOR表達(dá)與年齡、性別、腫瘤分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

p-p70S6K與腫瘤分級、分期、是否多發(fā)相關(guān)。隨著腫瘤分級分期的增加，p-p70S6K表達(dá)陽性率相應(yīng)增加；多發(fā)性膀胱尿路上皮癌p-p70S6K表達(dá)陽性率（45.9%）高于單發(fā)組（17.1%）；復(fù)發(fā)組（30.3%）高于未復(fù)發(fā)組（17.4%）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；p-mTOR表達(dá)與年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1。

2.3 p-mTOR、p-p70S6K表達(dá)與膀胱尿路上皮癌預(yù)后分析 單因素分析結(jié)果顯示腫瘤分級、分期、數(shù)目及p-mTOR、p-p70S6K表達(dá)均與腫瘤無瘤生存具有相關(guān)性；單因素分析中所得出的對膀胱尿路上皮癌預(yù)后有影響的因素用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，腫瘤分級、分期、數(shù)目及p-mTOR表達(dá)分別是膀胱腫瘤無瘤生存的預(yù)后因子，p-p70S6K表達(dá)在單因素分析中與預(yù)后相關(guān)，在最終的多因素模型中卻未能顯示其有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表3、表4。

表3 膀胱尿路上皮癌無瘤生存率的單因素分析(n=201)

表4 膀胱尿路上皮癌無瘤生存率的多因素分析(n=201)

3 討論

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白是雷帕霉素的靶分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。mTOR通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞能量代謝、血管生成等多種途徑，控制細(xì)胞增殖、生長、分化[2]。mTOR上游通過PI3K/AKT通路或PI3K/AKT/TSC2通路被激活，激活后的mTOR可調(diào)節(jié)核糖體S6蛋白激酶（S6K）和真核細(xì)胞始動因子4E結(jié)合蛋白1（4EBP1）的合成，它們是蛋白翻譯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，分別控制特定亞組mRNA的翻譯[3]。

Puzio-Kuter等[4]報(bào)道，腫瘤抑制基因p53和pten的失活，能夠促進(jìn)膀胱腫瘤向浸潤性發(fā)展，與膀胱腫瘤的預(yù)后相關(guān)，而其作用機(jī)制正是通過激活mTOR信號通路實(shí)現(xiàn)的。因此，我們推測，mTOR通路是膀胱腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要通路。

p-mTOR、p-p70S6K與腫瘤發(fā)生有關(guān)，p-mTOR、p-p70S6K在膀胱腫瘤中的表達(dá)較正常組織明顯增加。已知的研究表明，p-mTOR、p-p70S6K促進(jìn)蛋白的合成，表明mTOR/p70S6K的激活使膀胱上皮生長活躍，與膀胱腫瘤的發(fā)生有關(guān)，目前在膀胱腫瘤中尚無相關(guān)研究。Dai等[5]用免疫組化法檢測了前列腺組織中p-mTOR相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，在癌前病變HGPIN階段，p-mTOR通路蛋白表達(dá)高于正常前列腺癌組織，而低于前列腺癌，表明p-mTOR促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生。

我們分析了p-mTOR、p-p70S6K與年齡、性別、腫瘤分期、分級的關(guān)系。結(jié)果表明，p-mTOR、p-p70S6K與患者年齡、性別無關(guān)（P＞0.05），而與膀胱癌的分期、分級及腫瘤是否多發(fā)相關(guān)。在類似的研究中，Hansel等[6]檢測了121例浸潤性膀胱癌p-mTOR、p-70S6K的表達(dá)情況，p-mTOR、p-70S6K在低分級分期膀胱腫瘤中表達(dá)，表明是膀胱腫瘤發(fā)生的早期時(shí)間；在高分級分期腫瘤中，p-mTOR表達(dá)增高，與腫瘤病理分期、預(yù)后相關(guān)。表明p-mTOR的激活會導(dǎo)致腫瘤侵襲性的增加，研究結(jié)論與本文一致。這在許多其他腫瘤研究中有相似的結(jié)論，如宮頸癌、胃癌、腎癌。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，二者與腫瘤是否多發(fā)存在相關(guān)性，表明p-mTOR/p-70S6K通路的激活導(dǎo)致膀胱上皮細(xì)胞增生活躍，易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞多發(fā)。

我們還分析了膀胱腫瘤預(yù)后的預(yù)后因素，p-mTOR與腫瘤的病理分期、分級一樣，是腫瘤的獨(dú)立預(yù)后因子，p-mTOR表達(dá)增加的患者預(yù)后差，尤其表現(xiàn)在腫瘤復(fù)發(fā)率高于正常表達(dá)者。由于研究對象的隨訪時(shí)間較短，死亡率不高，我們未分析二者與死亡率的差異。但是Hansel等[6]補(bǔ)充了這一不足，他們的研究結(jié)果表明，p-mTOR與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤預(yù)后相關(guān)。類似的研究結(jié)果在膽管癌、乳腺癌、宮頸癌、胃癌中都有報(bào)道[7-8]。

mTOR/p70S6K通路的激活會引起膀胱上皮增生活躍，導(dǎo)致膀胱腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移，p-mTOR是膀胱癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素。對mTOR通路在膀胱尿路上皮癌中的研究，有助于闡明膀胱癌發(fā)病機(jī)制，并為以mTOR為靶點(diǎn)的抑制劑用于治療膀胱腫瘤提供依據(jù)。

[1]劉飛,彭鄂軍,李有元,等.EZH2和PTEN在膀胱癌的表達(dá)及預(yù)后分析[J].中國腫瘤臨床,2010,37(21),1220-1223.

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（收稿：2013-03-22 修回：2013-08-26）

（責(zé)任編輯 張亞強(qiáng)）

Expression of p-mTOR and p-p70S6K in Urothelial Bladder Cancer

CHEN Ye-gang,YANG Tuo,LIU Peng,et al Department of Urology,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin(300100),China

ObjectiveTo investigate the expression of p-mTOR and p-p70S6K in human bladder cancer tissues and the correlation with the prognosis.MethodsThe expression of p-mTOR and p-p70S6K was de?tected in normal bladder tissues and bladder cancer tissues by immunohistochemistry.Their relationship with clinicopathological characteristics and prognosis was analysed by Kaplan-Meier method and Log rank test.ResultsThe expression of p-mTOR in bladder cancer tissues was 43.3%,higher than 17.5%in normal blad?der tussues.The positive rate of p-mTOR expression increased with the progress of pathological stage and tumor grade.The expression of p-mTOR was 70.5%in multiple bladder tumors,higher than 31.4%in single bladder tumor;70.5%with positive expression of p-mTOR relapsed,higher than 31.4%without recurrence.The expres?sion of p-p70S6K in bladder cancer tissues was 25.9%,higher than 7.5%in normal bladder tussues.The posi?tive rate of p-p70S6K expression increased with the progress of pathological staging and tumor grade.The ex?pression of p-p70S6K was 45.9%in multiple bladder tumors than 17.1%in single bladder tumor;30.3%with positive expression of p-p70S6K relapsed,higher than 17.4%without recurrence.The difference was statistical significant.The pathological staging,tissue grade,number of tumors and expression of p-mTOR were identified as independent prognostic factors for bladder cancer by univariate and multivariate Cox regression analysis.ConclusionThe mTOR/p-mTOR/p-p70S6K pathway was correlated with tumor oncology and tumor progress, p-mTOR protein was an independent prognostic factor for bladder cancer.

Mammalian target of rapamycin;ribosomal protein S6 kinase;urothelial bladder cancer

R730.261

A

1007-6948(2013)06-0639-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.06.009

1.天津市南開醫(yī)院泌尿外科（天津 300100）

2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科（天津 300211）