朱永鋒，張春霆，張洪團(tuán)，張昌文，徐 勇

組織芯片檢測(cè)Claudin-3在前列腺癌中的表達(dá)

朱永鋒1，張春霆2，張洪團(tuán)3，張昌文3，徐 勇3

目的：檢測(cè)Claudin-3在前列腺癌中的表達(dá)情況，探討其與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法：采用組織芯片技術(shù)構(gòu)建包含64例前列腺癌和39例前列腺增生組織的64點(diǎn)陣石蠟組織芯片，用免疫組化SP法檢測(cè)該芯片中Claudin-3的表達(dá)，分析其與前列腺癌Gleason評(píng)分和臨床分期的關(guān)系。結(jié)果：前列腺癌Claudin-3陽(yáng)性表達(dá)率為60.94%（39/64），前列腺增生表達(dá)率17.95%（7/39）（P＜0.05）；Claudin-3與前列腺癌Gleason評(píng)分和臨床分期明顯相關(guān)。結(jié)論：Claudin-3異常表達(dá)與前列腺癌發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

前列腺癌；Claudin-3；組織芯片；免疫組織化學(xué)

前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展是一個(gè)多因素多階段的過(guò)程，涉及多個(gè)基因突變及表達(dá)異常。Claudins是緊密連接結(jié)構(gòu)中的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)和功能的改變是許多疾病的基礎(chǔ)[1]，其家族成員Claudin-3與前列腺癌的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。我們利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色鏈霉菌抗生物素蛋-過(guò)氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）法，對(duì)Claudin-3在前列腺癌中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，探討其與前列腺癌的臨床病理聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 64例前列腺癌組織標(biāo)本來(lái)自浙江大學(xué)金華醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院2007年1月—2010年1月病理組織庫(kù)標(biāo)本，患者年齡57～69歲，平均（54.5±8.5）歲。前列腺增生組織取自同期非腫瘤患者，39例患者年齡52～71歲，平均（56.5±6.5）歲。兩組年齡相比無(wú)顯著性差異。前列腺癌根據(jù)2002年TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，I～I(xiàn)I期41例，III～I(xiàn)V期23例。Gleason評(píng)分＜7分的36例，Gleason評(píng)分≥7分的28例。前列腺癌術(shù)前均未接受放療、化療和內(nèi)分泌治療，標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，3 μ m厚連續(xù)切片。

1.2 方法 SP試劑盒和DAB顯色劑均為北京中杉生物技術(shù)公司產(chǎn)品。構(gòu)建2個(gè)8×8點(diǎn)陣的組織芯片，一個(gè)用于免疫組化染色，一個(gè)用于陰性對(duì)照。對(duì)所制成芯片的所有組織（須有與其匹配的標(biāo)記完成的HE片）進(jìn)行點(diǎn)陣。根據(jù)標(biāo)記，利用點(diǎn)陣儀對(duì)標(biāo)記完成的組織進(jìn)行打點(diǎn)取樣，黏附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。每例前列腺癌標(biāo)本和前列腺增生組織標(biāo)本均取1個(gè)點(diǎn)。烤片6 h，芯片制作完成。應(yīng)用SP法進(jìn)行兔抗人Claudin-3蛋白單克隆抗體免疫組化染色。組織切片60℃烤片，常規(guī)脫蠟、抗原修復(fù)，0.3%H2O2-甲醇封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物10 min，滴加一抗（1∶100），4℃冰箱過(guò)夜。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。次日滴加生物素標(biāo)記的二抗（兔）及鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶，均室溫孵育12 min。各步驟間均以0.1%Tween-PBS洗5 min×3次。最后DAB顯色，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定 Claudin-3染色主要是細(xì)胞膜出現(xiàn)棕紅色顆粒為陽(yáng)性染色，細(xì)胞漿及細(xì)胞核表達(dá)很少，根據(jù)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)區(qū)分表達(dá)等級(jí)。（-）為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜10%，（+）為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)10%～25%，（++）為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＞50%，（+++）為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＞75%。陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＞10%陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤10%為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)染色結(jié)果用成組設(shè)計(jì)兩樣本陽(yáng)性率比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)（或者Fisher概率法），P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Claudin-3在前列腺癌中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Claudin-3主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，而在胞質(zhì)及胞核中表達(dá)不明顯（見(jiàn)圖1、圖2）。

圖1 Claudin-3在前列腺增生組織中的表達(dá)（×100）

2.2 Claudin-3在前列腺癌和增生組織中的表達(dá)Claudin-3在前列腺癌中呈高表達(dá)，染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于前列腺增生組織。在前列腺癌組織中表達(dá)的陽(yáng)性率為60.94%（39/64），在前列腺增生組織中陽(yáng)性表達(dá)率為17.95%（7/39）。見(jiàn)表1。

2.3 Claudin-3表達(dá)與前列腺癌Gleason評(píng)分和臨床分期之間的關(guān)系 Claudin-3在36例前列腺癌＜7分的陽(yáng)性表達(dá)率為41.67%（15/36），Claudin-3在28例前列腺癌≥7分的表達(dá)率為85.71%（24/28），兩者之間比較有差異。在前列腺癌臨床分期中，I～I(xiàn)I期表達(dá)率53.66%（22/41）和III～I(xiàn)V期陽(yáng)性表達(dá)率為82.61%（19/23），兩者相比有明顯差異。見(jiàn)表1。

表1 Claudin-3在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達(dá)

3 討論

前列腺癌是歐美國(guó)家常見(jiàn)的腫瘤[2]，其疾病特異性死亡率有上升趨勢(shì)[3]。近年來(lái)，前列腺癌在我國(guó)呈逐漸增加趨勢(shì)[4]。由于我國(guó)目前大多不能早期發(fā)現(xiàn)，同時(shí)很大一部分患者由于發(fā)現(xiàn)較晚，亦錯(cuò)失手術(shù)時(shí)機(jī)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌與多種基因有關(guān)。Claudin-3基因參與了多種腫瘤的發(fā)生進(jìn)展，其翻譯的蛋白屬于一類(lèi)跨膜緊密連接蛋白，主要作用是維持細(xì)胞的極性和細(xì)胞間屏障功能[5-6]，在跨膜蛋白在細(xì)胞間的傳輸轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要作用，也是細(xì)胞黏附功能的基礎(chǔ)。其異常表達(dá)使上皮滲透屏障破壞,細(xì)胞極性喪失,細(xì)胞間黏附力下降,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。

Claudin-3蛋白及其他緊密連接蛋白的表達(dá)異常，目前被認(rèn)為是細(xì)胞間黏附性丟失的機(jī)制和腫瘤細(xì)胞發(fā)生及轉(zhuǎn)移的重要步驟。然而在多數(shù)腫瘤組織中，Claudin-3表達(dá)水平明顯較正常組織中高，這意味著Claudin-3表達(dá)的上調(diào)在腫瘤的發(fā)生中也起促進(jìn)作用。本研究采用組織芯片技術(shù)，對(duì)前列腺癌組織和前列腺增生組織進(jìn)行了研究，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌和良性前列腺增生組織中表達(dá)水平有顯著的差異，在前列腺癌組織中Claudin-3表達(dá)的陽(yáng)性率為60.94%（39/64），在前列腺增生組織中陽(yáng)性表達(dá)率為17.95%（7/39）。結(jié)果表明，Claudin-3在前列腺癌和良性前列腺增生組織表達(dá)變化與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展可能有密切關(guān)系。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌中36例Gleason評(píng)分＜7分的陽(yáng)性表達(dá)率為41.67%（15/36），在28例前列腺癌Gleason評(píng)分≥7分的表達(dá)率為85.71%（24/28），兩者之間比較有差異。在對(duì)前列腺癌臨床分期中，I～I(xiàn)I期表達(dá)率53.66%（22/41），III～I(xiàn)V期陽(yáng)性表達(dá)率為82.61%（19/23），兩者相比有明顯差異。說(shuō)明其表達(dá)與前列腺癌的臨床分期和Gleason評(píng)分有關(guān)，Claudin-3的異常表達(dá)參與了前列腺癌的發(fā)生和進(jìn)展。本研究利用Claudin-3與產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素 (clostridium perfringens enterotoxin，CPE)的受體結(jié)合，靶向干擾Claudin-3，前列腺癌細(xì)胞系PC3/DU145細(xì)胞增殖能力下降，細(xì)胞遷移能力降低。據(jù)此可以通過(guò)CPE作為載體，為靶向干擾Claudin-3對(duì)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生特異性的細(xì)胞溶解作用[9]。靶向干擾Claudin-3表達(dá)上調(diào)的腫瘤治療新方法提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為前列腺癌的治療提供了新的思路。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化SP技術(shù)對(duì)組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)Claudin-3在前列腺癌中高度表達(dá)，其表達(dá)主要在細(xì)膜上，而在胞質(zhì)及胞核中表達(dá)不明顯。Claudin-3在前列腺癌的細(xì)胞膜中表達(dá)增強(qiáng)，這可能與它參與前列腺癌發(fā)生發(fā)展細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，在前列腺增生組織Claudin-3亦呈低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，這說(shuō)明雖然Claudin-3在前列腺癌中的表達(dá)不具有特異性，但前列腺癌早期即發(fā)現(xiàn)有Claudin-3異常表達(dá)，也使Claudin-3在前列腺癌的早期診斷中可能具有重要價(jià)值。同時(shí)，前列腺增生時(shí)的低表達(dá)說(shuō)明Claudin-3在前列腺癌的發(fā)生中可能具有非常重要的作用，其在腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖中可能發(fā)揮非常重要的作用。國(guó)內(nèi)畢罡等[10]采用免疫組化法半定量測(cè)定前列腺癌80例、前列腺增生組織20例中Claudin-3的表達(dá)，并用蛋白印跡結(jié)合圖像分析法定量測(cè)定前列腺癌和前列腺增生組織的Claudin-3的表達(dá)，結(jié)果也顯示，前列腺癌組織中Claudin-3的表達(dá)顯著高于良性前列腺增生組。據(jù)此推測(cè)，Claudin-3可能對(duì)診斷前列腺癌有輔助診斷作用，Claudin-3可能是前列腺癌發(fā)生和演進(jìn)中的早期事件之一。研究顯示，Claudin-3表達(dá)上調(diào)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)機(jī)制可能是：Claudin-3表達(dá)的上調(diào)是促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲力和生存力,而這種效應(yīng)可能與增強(qiáng)了基質(zhì)金屬蛋白酶-2的活性有關(guān)[11]。Claudin-3可被WNK4激酶催化磷酸化，推測(cè)Claudin-3可能有磷酸化后破壞細(xì)胞間緊密連接的正常功能。最近對(duì)Claudin-1研究結(jié)果顯示，Claudin-1過(guò)表達(dá)還可以抑制E-cadherin表達(dá)，失去E-cadherin表達(dá)使E-cadherin/Tcf信號(hào)通路上調(diào)[12]。但是Claudin-3在前列腺癌中表達(dá)上調(diào)是否有相同的機(jī)制起作用，還需要進(jìn)一步研究。

本研究將組織芯片技術(shù)和免疫組化技術(shù)相結(jié)合，同時(shí)對(duì)多個(gè)前列腺癌和前列腺增生組織進(jìn)行了Claudin-3蛋白的檢測(cè)，相對(duì)于普通切片，具有以下優(yōu)點(diǎn)：⑴體積小，信息含量高；⑵最大限度地利用有限的標(biāo)本資源；⑶適用于形態(tài)學(xué)觀察，并可進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的觀察和研究；⑷高效、快速、低消耗、自身內(nèi)對(duì)照，可比性強(qiáng)。我們的研究結(jié)果顯示Claudin-3表達(dá)的上調(diào)與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān),在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。但Claudin-3功能復(fù)雜多樣，其在前列腺癌發(fā)生進(jìn)展中的作用遠(yuǎn)未闡明，尚需更進(jìn)一步研究。

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（收稿：2012-12-09 修回：2013-09-12）

（責(zé)任編輯 張亞強(qiáng)）

Expression and Significance of Claudin-3 in Prostate Cancer with Tissue Microarray

ZHU Yong-feng,ZHANG Chun-ting,ZHANG Hong-tuan，et al Department of Urology,Jinhua People’s Hospital of Zhejiang Province,Jinhua(321000),China

ObjectiveTo investigate relationship of the generation and development of prostate cancer through detecting Claudin-3 expression of prostate cancer.MethodsTissue microarray technology were used to be built the lattice containing 64 patients with prostate cancer tissue and 39 patients with benign prostatic hy?perplasia tissue were arranaged for paraffin microarray and immunohistochemical SP method was used to detect Claudin-3 expression in the chip,the relationship between prostate cancer with Gleason score and the clinical stage was analyzed.ResultsIn 64 patients with prostate cancer,Claudin-3 positive expression rate was 60.94%(39/64),compared with in those with benign prostatic hyperplasia 17.95%（7/39）,there was significant difference,Claudin-3 expression in prostate cancer was significantly related to Gleason score and clinical stage（P＜0.05）.ConclusionAbnormal expression of Claudin-3 is closely related to generation and development of prostate cancer.

Prostate cancer Claudin-3;tissue microarray;immunohistochemistry

R737.25

A

1007-6948(2013)06-0636-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2013.06.008

1.浙江省金華市人民醫(yī)院泌尿外科（金華 321000）

2.浙江大學(xué)金華醫(yī)院泌尿外科（金華 321000）

3.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科（天津 300211）

徐 勇，E-mail:xuyong1955@sina.com