任 琳，趙 冰，趙 燕，陳文華，李家鵬，榮 慧，張春江，喬曉玲*

(中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068)

北京烤鴨加工過程中菌相變化規(guī)律及其特征

任 琳，趙 冰，趙 燕，陳文華，李家鵬，榮 慧，張春江，喬曉玲*

(中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068)

應(yīng)用微生物選擇性培養(yǎng)并結(jié)合細(xì)菌系統(tǒng)鑒定的方法對北京烤鴨加工過程中的菌相變化規(guī)律及其特征進(jìn)行分析和研究。結(jié)果顯示：乳酸菌是整個(gè)加工過程中的主要微生物為3.41～5.97(lg(CFU/g))，受溫度影響較?。患賳伟鷮僭诩庸で捌?解凍、清洗)分別是4.77(lg(CFU/g))和4.39(lg(CFU/g))，為僅次于乳酸菌的主要微生物，受溫度影響較大；腸桿菌科在加工中期(燙皮、晾掛)與乳酸菌達(dá)到相同數(shù)量級分別是3.18(lg(CFU/g))和5.96(lg(CFU/g))，成為僅次于乳酸菌的主要微生物?？绝喌臓C皮、烤制工序能有效降低各類菌的含量，滅菌后菌含量低于1.00(lg(CFU/g))；晾掛工序是整個(gè)加工過程中微生物出現(xiàn)增長的階段，各類菌的數(shù)值在4.29～6.36(lg(CFU/g))，因此需嚴(yán)格控制晾掛的溫度、濕度和時(shí)間，以確保產(chǎn)品的安全性。本研究表明，乳酸菌、假單胞菌屬和腸桿菌科是北京烤鴨加工過程中的主要微生物。

菌相變化；選擇性培養(yǎng)；鑒定；北京烤鴨

烤鴨是我國熏燒焙烤肉制品的典型代表之一，根據(jù)加工工藝的不同，主要分為掛爐烤鴨和燜爐烤鴨兩大類[1]。全國各地都有烤鴨的制作方法[2-4]，其中北京烤鴨由于其鮮嫩適度、肥瘦分明、味道醇厚蜚聲海內(nèi)外，深受消費(fèi)者喜愛[5]。2011年北京出現(xiàn)的黑心烤鴨事件[6]引起了社會的廣泛關(guān)注。由于肉制品的品質(zhì)變化可以由不同的原料選擇、生產(chǎn)工藝以及微生物菌相等多種內(nèi)外因素共同作用引發(fā)[7]，原料肉中的初始微生物由許多種構(gòu)成[8]，而微生物是造成安全隱患的重要因素之一。因此，了解和研究烤鴨從原料到成品的加工過程中菌相的變化規(guī)律是保證產(chǎn)品質(zhì)量安全以及改良烤鴨品質(zhì)的基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)有冷卻肉[9-11]、臘肉[12]和塊狀火腿[13]加工過程以及燒雞[14]、鹽水鴨[15]和低溫熏煮香腸[16]等肉制品貯藏過程中腐敗微生物初始菌相及其變化規(guī)律的研究。但針對熏燒焙烤肉制品如烤鴨產(chǎn)品的研究主要集中在烤鴨的制作工藝[2-4]、風(fēng)味[17-18]以及有害物檢測[19-20]等方面，而貫穿其從原料到成品加工過程中菌相變化規(guī)律的分析和鑒定還尚未有相關(guān)深入的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對北京烤鴨加工過程中菌相變化規(guī)律的分析及其特征研究，為進(jìn)一步改善烤鴨加工工藝、延長產(chǎn)品貨架期、制修定烤鴨產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評估、標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)范提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

北京烤鴨由中國肉類食品綜合研究中心實(shí)驗(yàn)廠車間當(dāng)天生產(chǎn)的，取樣后立即進(jìn)行菌相分析。

革蘭氏染液、1%鹽酸二甲基對苯二胺、10%過氧化氫、凡士林、液體石蠟(均為分析純) 北京化學(xué)試劑公司。

平板計(jì)數(shù)瓊脂、MRS培養(yǎng)基、MSA瓊脂、VRBD瓊脂、PSA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、休和利夫森二氏Hugh-Leifson培養(yǎng)基(O/F培養(yǎng)基)、索恩利Thornley培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

202A-0恒溫干燥箱 上海和盛有限公司；SL502N型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；BH-2型生物顯微鏡 日本Olympus公司；F1-45型恒溫培養(yǎng)箱、G154DWS濕熱滅菌鍋、FSP-625型干熱滅菌箱 日本三洋公司；pH計(jì) 德國Ebro公司。

1.3 方法

烤鴨加工工藝流程：原料解凍→清洗→燙皮→晾掛→烤制→真空包裝→滅菌。

主要參數(shù)：解凍5℃，清洗8℃，燙皮100℃、2s；晾掛，先4℃，14h，再18℃，3h；烤制150℃，30min；滅菌121℃，40min。

將烤鴨的每一步加工工藝作為取樣點(diǎn)，樣品處理方法參照GB/T 4789.2ü2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[21]。

菌相變化分析：采用選擇性培養(yǎng)基對烤鴨加工過程中的細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌、葡萄球菌和微球菌、腸桿菌科、假單胞菌屬以及酵母和霉菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。具體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件如表1所示。

表 1 北京烤鴨加工過程中各類菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 1 Selective media and incubation conditions used for bacterial isolation from Beijing roast duck

主要微生物的分離：從烤鴨加工過程中主要微生物的選擇性培養(yǎng)基上挑取特征典型的菌落，進(jìn)行反復(fù)劃線分離，得到純化的單菌落。

主要微生物的特征分析與初步鑒定：觀察并詳細(xì)記錄已分離純化的單個(gè)菌落的大小、形態(tài)、隆起程度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)、光澤度、透明度、質(zhì)地及顏色等菌落形態(tài)特征；挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察并描述各類菌的細(xì)胞形狀、胞間排列方式等；進(jìn)行生長溫度、耐鹽性、氧化酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化發(fā)酵和精氨酸雙水解等生理生化實(shí)驗(yàn)，根據(jù)Brown[22]推薦的肉品中微生物鑒定圖譜，并結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]鑒定主要微生物的科和屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤鴨加工過程中的菌相變化分析

圖 1 北京烤鴨加工過程中的菌相變化規(guī)律Fig.1 Microf l ora variation in Beijing roast duck during processing

由圖1可知，各種菌的變化趨勢基本一致。經(jīng)過清洗和燙皮工序后，各種菌逐漸減少，數(shù)值在2.24～5.11(lg(CFU/g))；晾掛后，各種菌數(shù)值上升，為4.29～6.36(lg(CFU/g))；經(jīng)過烤制后，各種菌數(shù)大幅下降，在0.70～3.57(lg(CFU/g))；滅菌后，菌數(shù)低于1.00(lg(CFU/g))。其中，在燙皮、烤制和滅菌步驟中，各目標(biāo)菌的數(shù)值降低，這是由于在這些加工工序中，溫度均達(dá)到100℃及以上，分別是100、150、121℃。較高溫度使得微生物中的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，一些酶失活[24]，從而可以有效殺死各類菌。而晾掛工序使得各目標(biāo)菌的數(shù)值上升，是由于晾掛工序中的相對濕度為80%～90%，在本實(shí)驗(yàn)所取的樣品生產(chǎn)過程中為達(dá)到烤鴨表皮干燥的效果，需要在4℃和18℃的條件下晾掛14～17h。由于肉制品的菌相變化與水分含量和水分活度的變化息息相關(guān)，相關(guān)性在95%以上[25]。因此，較大的相對濕度以及較長的操作時(shí)間有利于各類菌的生長繁殖，這可能是造成晾掛工序中各類菌數(shù)值升高的原因。

另外，從圖1中還可以看出：在解凍、清洗、燙皮、晾掛和烤制過程中，細(xì)菌總數(shù)在3.57～6.36(lg(CFU/g))，滅菌后細(xì)菌總數(shù)＜1.00(lg(CFU/g))。目前在食品工業(yè)中，熱處理仍然是最簡便易行的殺菌方法之一[26-28]?？绝喌臏缇捎玫氖歉邷馗邏?121℃，40min)滅菌方式，食品經(jīng)過高溫高壓滅菌后雖然不能殺死其中的全部微生物，但卻可以大大降低產(chǎn)品初始細(xì)菌總數(shù)，達(dá)到商業(yè)無菌狀態(tài)，從而延長產(chǎn)品的貨架期[29]。乳酸菌在烤鴨加工過程中是3.41～5.97(lg(CFU/g))，為加工過程中的主要微生物。這是由于乳酸菌在有氧和低氧條件下均可良好生長，而且乳酸菌在其生長繁殖的過程中可導(dǎo)致微生物生長環(huán)境中的pH值降低，并產(chǎn)生一些如乳桿菌素(lactocidin)等物質(zhì)，對其他微生物的生長和繁殖具有抑制作用[30]。另外，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示滅菌后仍有含量低于1.00(lg(CFU/g))的乳酸菌存活，這可能是由于乳酸菌具有良好的耐溫性[16]，同時(shí)這也提示，對于產(chǎn)品熱加工時(shí)應(yīng)予以特別注意以及開發(fā)針對乳酸菌的抑制技術(shù)。假單胞菌屬在加工前期的解凍和清洗過程中分別是4.77(lg(CFU/g))和4.39(lg(CFU/g))，是僅次于乳酸菌的主要微生物，燙皮后降為2.80(lg(CFU/g))，烤制后菌落總數(shù)＜1.00(lg(CFU/g))，滅菌后未檢出。這顯示，假單胞菌屬的生長和存活狀況受溫度影響較大。由于假單胞菌屬在有氧和較低溫度條件下，生長速率具有明顯優(yōu)勢[31]，在烤鴨生產(chǎn)過程中原料的解凍和清洗分別在5℃和8℃條件下進(jìn)行，因此較低的溫度有利于假單胞菌屬的生長，這和大部分研究結(jié)果顯示的假單胞菌屬是引起冷卻肉腐敗的主要微生物結(jié)論一致[32-35]。腸桿菌科在加工中期的燙皮和晾掛過程中分別增加到3.18(lg(CFU/g))和5.96(lg(CFU/g))，成為僅次于乳酸菌的主要微生物，烤制后＜1.00(lg(CFU/g))，滅菌后未檢出。這是由于在適宜的環(huán)境條件下，腸桿菌科會富集，同樣具有很強(qiáng)的致腐能力并產(chǎn)生含有胺類物質(zhì)的異味[36]。因此，應(yīng)對晾掛工序中的溫度、濕度和操作時(shí)間予以嚴(yán)格控制，以確保食品的食用安全性。葡萄球菌和微球菌以及酵母菌和霉菌在解凍、清洗、燙皮、晾掛和烤制過程中為2.22～4.94(lg(CFU/g))，滅菌后均未檢出。因此，葡萄球菌和微球菌以及酵母菌和霉菌不是烤鴨生產(chǎn)過程中的主要微生物。

2.2 主要微生物的特征研究

對來源于MRS、PSA和VRBD選擇性培養(yǎng)基平板上的典型菌落進(jìn)行劃線分離，將得到的純化菌落進(jìn)行初步鑒定。表2為北京烤鴨加工過程中主要微生物的初步鑒定結(jié)果：M-1為革蘭氏陽性、桿狀、氧化酶和接觸酶皆陰性、41℃和5% NaCl條件下均能良好生長的細(xì)菌；M-2為革蘭氏陽性、氧化酶和接觸酶皆陰性、30℃生長良好、5% NaCl不能生長的球菌；P-1和P-2是革蘭氏陰性、短桿、氧化酶陽性、接觸酶陽性、葡萄糖氧化產(chǎn)酸型細(xì)菌；V-1為革蘭氏陰性、桿狀、氧化酶陰性、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸型細(xì)菌。根據(jù)Brown[22]推薦的肉品中微生物鑒定圖譜，并結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[23]初步鑒定M-1為乳桿菌屬(Lactobacillus)，M-2為乳球菌屬(Lactococcus)，P-1、P-2為假單胞菌屬(Pseudomonas)，V-1為腸桿菌科(Enterbacteriaceae)。

以上給出的是各選擇性培養(yǎng)基平板上典型菌落的初步鑒定結(jié)果，其他菌落的鑒定結(jié)果未列出。從初步鑒定結(jié)果可以進(jìn)一步說明乳酸菌、假單胞菌屬和腸桿菌科細(xì)菌是北京烤鴨加工過程中的主要微生物。另外，如需對北京烤鴨生產(chǎn)過程中主要微生物進(jìn)行更精確的菌種分析和鑒別，則需進(jìn)行碳源實(shí)驗(yàn)[10]并結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行。目前，16S rRNA基因克隆和序列分析的方法正在被應(yīng)用于對冷卻肉的微生物菌相分析的實(shí)驗(yàn)中[37-38]。因此，利用16S rRNA基因克隆和序列分析以及碳源實(shí)驗(yàn)等方法對烤鴨加工過程中主要微生物進(jìn)行菌種鑒別需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

表 2 北京烤鴨加工過程中主要微生物的初步鑒定結(jié)果Table 2Results of primary identif i cation of dominant microorganisms in Beijing roast duck

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過對北京烤鴨加工過程中菌相變化規(guī)律的分析及其特征的研究得到：在烤鴨加工過程中，各種菌的變化趨勢基本一致，其中乳酸菌是烤鴨加工過程中的主要微生物，為3.41～5.97(lg(CFU/g))；假單胞菌屬和腸桿菌科分別為加工前期(解凍、清洗)和加工中期(燙皮、晾掛)僅次于乳酸菌的主要微生物，分別達(dá)到4.77、4.39、3.18、5.96(lg(CFU/g))。另外，在燙皮、烤制以及滅菌步驟中，各目標(biāo)菌的數(shù)值降低，其中受溫度影響最大和最小的菌群分別是假單胞菌屬和乳酸菌；而晾掛工序中，在4℃和18℃的條件下，較大的相對濕度(80%～90%)以及較長的操作時(shí)間(14～17h)，可能是導(dǎo)致各類菌增加的原因。

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Microf l ora Variation and Characteristics of Beijing Roast Duck during Processing

REN Lin，ZHAO Bing，ZHAO Yan，CHEN Wen-hua，LI Jia-peng，RONG Hui，ZHANG Chun-jiang，QIAO Xiao-ling*
(China Meat Research Center, Beijing 100068, China)

The microflora variation and characteristics of Beijing roast duck at different stages of production were analyzed by the traditional selective culture and microf l ora systematic identif i cation. The results indicated that lactic acid bacteria were the most dominant microorganisms during the entire process (3.41ü5.97 (lg(CFU/g)) and inf l uenced little by temperature followed by Pseudomonas spp. during the early stages (thawing and cleaning), which was greatly inf l uenced by temperature, or Enterbacteriaceae spp., which reached the same order of magnitude as lactic acid bacteria (3.18 (lg(CFU/g)) and 5.96 (lg(CFU/g)), respectively) during the middle stages (skin blanching and natural air drying). The populations of various bacterial species declined to a level lower than 1.00 (lg(CFU/g)) during skin blanching and roasting. Bacterial growth was observed only at the stage of natural air drying during the whole production process, and the populations of various bacterial species ranged from 4.29 to 6.36 (lg(CFU/g)). Accordingly, temperature, humidity and drying time should be strictly controlled to ensure food safety. This study demonstrates that lactic acid bacteria, Pseudomonas spp. and Enterbacteriaceae spp. are dominant in Beijing roast duck during various stages of processing.

microf l ora variation；traditional selective culture；identif i cation；Beijing roast duck

TS201.3

A

1002-6630(2013)01-0281-04

2012-08-28

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201110209)

任琳(1981ü)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槿忸愂称钒踩?。E-mail：renlin7684@sina.com

*通信作者：喬曉玲(1964ü)，女，教授級高工，本科，研究方向?yàn)槿馄芳庸ぜ夹g(shù)。E-mail：cmrcsen@126.com