華承偉，于江傲，謝鳳珍，陳曉靜

(1.河南科技學院生命科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學院新科學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

擬青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶同源建模及共價固定化

華承偉1，于江傲1，謝鳳珍2，陳曉靜2

(1.河南科技學院生命科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南科技學院新科學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

采用同源建模的方法構建擬青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶的三維結構。通過對其活性位點及表面氨基酸殘基側鏈的分析，利用氨基載體Sepabeads EC-HA共價固定化葡聚糖酶，優(yōu)化固定化條件，比較固定化酶與游離酶的酶學參數(shù)。結果表明：m(酶粉):m(載體)=1.2:1、溫度40～45℃、固定化時間8h，固定化效果最好。蛋白結合率可達91.7%，酶活回收率達87.6%，固定化酶最適溫度、熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和批次使用穩(wěn)定性均得到明顯提高。

β-1,3(4)-葡聚糖酶；同源建模；共價固定化

β-葡聚糖是由β-D-葡萄糖殘基通過β-1,3或β-1,4-糖苷鍵連接而成的多聚糖，是谷類植物細胞壁的主要組分，廣泛存在于大麥、黑麥、小麥和稻米等禾本科谷物及酵母中[1]，與阿拉伯木聚糖、戊聚糖、纖維素、果膠等均屬植物細胞壁中的可溶性結構性非淀粉多糖。β-葡聚糖酶作為一種重要的工業(yè)用酶，在啤酒工業(yè)、功能性食品、制糖、造紙、日化及飼料工業(yè)中有重要的應用價值。固定化酶可以克服游離酶的不穩(wěn)定性，具有可反復或連續(xù)使用、易與反應產(chǎn)物分離等顯著優(yōu)點，對于解決部分價格昂貴及稀有酶來源、降低生產(chǎn)成本具有重要的意義。固定化技術經(jīng)過30多年的發(fā)展，但真正應用于工業(yè)化的固定化酶并不多，主要是因為固定化酶的過程中還存在幾個亟待解決的難題：酶的活性中心發(fā)生物理化學變化導致酶活力降低；酶固定化后多了空間屏障，增加了傳質阻力；酶和載體結合不牢固，容易脫落，酶活力損失大；固定化顆粒成型困難等[2-3]。如何解決這些問題是固定化技術的熱點，研究者不斷地對固定化載體改良并提出新的載體和固定化方法[4-7]，并在酶的共價固定和定向固定化等方面作了大量研究。本實驗利用同源建模技術構建了來源于擬青霉的β-1,3(4)-葡聚糖酶的三維結構，通過分析其活性位點和表面氨基酸組成，利用酶蛋白側鏈氨基進行定向共價固定化研究。通過固定化的葡聚糖酶可用于啤酒工業(yè)及葡聚糖寡糖制造的連續(xù)生產(chǎn)，對于解決優(yōu)良酶制劑來源及降低生產(chǎn)成本具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酶制劑：擬青霉(Paecilomyces sp. FLH30)β-1,3(4)-葡聚糖酶(8649U/mg大麥葡聚糖)，由河南科技學院分離工程實驗室保藏畢赤酵母工程菌發(fā)酵純化自制；固定化載體：氨基型SEPABEADS EC-HA(EA)和環(huán)氧型SEPABEADS EC-EP(HFA)系列聚甲基丙烯酸球狀基質(Resindion S.r.l., Mitsubishi Chem. Corp., Japan)；大麥葡聚糖 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

TU-1901紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；RH-Q全溫振蕩器 江蘇金壇恒豐制造有限公司；HH-8恒溫水浴鍋 江蘇金壇環(huán)宇科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 同源建模

擬青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶(GenBank登錄號：HQ825092)由298個氨基酸殘基組成。模板搜索采用NCBI的BLASTp和PDB的BLAST程序，同源建模采用MODELLER(v9.10)程序和EasyModeller 2.0圖形操作界面[8-9]。由程序自動生成10個模型，選取概率密度函數(shù)(probability density functions，PDF)對蛋白質幾何性質打分最高的模型，用Procheck程序進行合理性評價。蛋白三維結構及顯示采用Pymol(v1.3.1)程序。

1.3.2 酶的固定化

環(huán)氧型SEPABEADS EC載體固定化：7mL離心管中，精確稱取一定量冷凍干燥的酶粉與載體混合，加入KH2PO4-K2HPO4緩沖液(1.25mol/L，pH8.0)，載體與緩沖液比為1:4(m/V)?；旌衔镏糜谌珳卣袷幤髦锌刂埔欢囟龋潭ɑ欢〞r間，靜置20h，振蕩頻率40次/min。90μm濾膜過濾混合物，回收載體及濾液，固定化酶分別用KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.02mol/L，pH8.0)、含0.5mol/L NaCl的KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.02mol/L，pH8.0)及醋酸緩沖液(0.1mol/L，pH5.0)各洗滌1次，除去未共價結合的酶蛋白，合并濾液，計算酶的蛋白結合量。固定化酶置于4℃冰箱保存。

氨基型SEPABEADS EC載體固定化：載體預先用含2g/100mL戊二醛的KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.02mol/L，pH8.0，載體:緩沖液為1:4)，于25℃活化1h，然后用同樣的緩沖液洗滌2次。固定化操作同上，但在固定化時，磷酸緩沖液濃度為0.02mol/L。

1.3.3 酶活力測定

酶活力的單位定義為：70℃、pH7.0的MES緩沖液及底物質量濃度為1g/100mL條件下，每分鐘生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。采用DNS法測定還原糖含量[10]。

1.3.4 蛋白含量測定

參照Lowry等[11]的方法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.3.5 最適pH值和最適溫度

在70℃條件下，分別測定固定化酶在pH2.5～11.0的4種不同緩沖液(50mmol/L，檸檬酸緩沖液pH2.5～5.5，MES緩沖液 pH5.0～7.0，磷酸緩沖液pH6.0～8.5，甘氨酸-NaOH緩沖液pH8.5～11.0)中的酶活力，以最高酶活力作為100%。為考察固定化酶在不同pH值條件下的穩(wěn)定性，一定量的固定化酶分別于上述緩沖液50℃保溫30min后冰浴30min測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理酶的酶活力為100%。分別于30～100℃測定酶活力(50mmol/L MES緩沖液pH7.0)，以最高酶活力作為100%，固定化酶于不同溫度下分別保溫、定時取樣測定殘余酶活力，以未經(jīng)處理酶的酶活力為100%，考察其熱穩(wěn)定性。結果為3次實驗數(shù)據(jù)的平均值。

2 結果與分析

2.1 同源建模及分析

NCBI和PDB數(shù)據(jù)庫BLSAT搜索結果顯示，擬青霉β-1,3(4)-葡聚糖酶與黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的內切β-1,3(4)-葡聚糖酶(PDB code，2CL2) 具有較高的序列相似度(similarity：55%)和一致性(identity：44%)。利用2CL2作為模板，利用MODELLER通過序列比對、模型建立、Loop和結構優(yōu)化，得到最終三維模型(圖1a)。使用Procheck程序對模型結構的立體化學參數(shù)進行了評價，該程序可以憑經(jīng)驗比較給定蛋白質結構與最合理的蛋白質結構之間立體化學性質的差異。評價結果中主要考察所有氨基酸殘基骨架的二面角分布，并通過程序生成的Ramachandran圖(圖1b)來表示。建模的蛋白質有97.7%的殘基落入中心區(qū)域(the core regions)，2.3%的殘基落入許可區(qū)(allowed regions)，無殘基落入不允許區(qū)(disallowed regions)。上述結果說明建模得到的葡聚糖酶模型氨基酸二面角結構是比較合理的。

圖 1β-1,3(4)-葡聚糖酶同源建模的模型(a)與Ramachandran圖(b)Fig.1 Three dimensional structure (a) and Ramachandran plot (b) of β-1,3(4)-glucanase from Paecilomyces sp. FLH30

三維模型顯示，該葡聚糖酶由兩個大的反向平行β-折疊層組成，兩個β-折疊層連接兩端的環(huán)(loops)(圖1a)，由4個二硫鍵Cys96～Cys265和Cys252～Cys272，Cys138～Cys234和Cys154～Cys167固定?；钚晕稽c氨基酸殘基EIDIIE和糖苷水解酶16家族活性位點氨基酸殘基EIDIE相似[12-15]，位于底物結合的狹溝中(圖2a)。整個酶分子含有6個賴氨酸(Lys)殘基位于酶分子表面，只有一個Lys殘基位于酶與底物結合狹溝的邊緣，且距催化中心氨基酸殘基較遠，其余5個Lys殘基遠離底物結合和催化位點(圖2b)，因此，可利用Lys殘基側鏈的ε-NH2進行酶的共價固定化。

圖 2β-1,3(4)-葡聚糖酶模型分子表面(a)及賴氨酸殘基側鏈分子表面(b)Fig.2 Molecular structure of β-1,3(4)-glucanase from Paecilomycessp. FLH30 (a) and Lys side chain (b)

2.2 葡聚糖酶的共價固定化

2.2.1 載體選擇

SEPABEADS?EC系列載體為高度多孔親水性聚甲基丙烯酸球狀基質，其中S級顆粒大小100～300μm，孔徑10～20nm；溫度穩(wěn)定范圍2～60℃；氨基型載體pH值穩(wěn)定范圍1～14，環(huán)氧型載體pH值穩(wěn)定范圍5～8；流速可達10m/h，對應壓力1.2bar/m。因此，具有穩(wěn)定的物理和化學性質、在高濃度溶液和通常溶劑中的低膨脹率和深度交聯(lián)，具有杰出的機械滲透穩(wěn)定性等優(yōu)點，適合工業(yè)生產(chǎn)應用。根據(jù)前述分析結果，選用氨基型SEPABEADS EC-HA/EA和環(huán)氧型SEPABEADS EC-EP/HFA這4種S級載體，分別取1g濕載體，加入0.25g酶粉，固定化18h，測定固定化效率(蛋白結合率)和酶活回收率。結果見表1。

表 1 4種Sepabeads EC載體固定化葡聚糖酶效果Table 1 Comparison of immobilization of β-1,3(4)-glucanase from Paecilomyces sp. FLH30 onto four different types of Sepabeads EC

兩種環(huán)氧型載體HFA和EP的功能基團最小密度分別為75、100μmol/g濕載體，但HFA型載體在蛋白結合率及酶活回收率方面都高于EP型載體，可能是由于HFA載體較EP載體具有更長的載體臂，利于蛋白結合及活性保持所致。兩種氨基型載體的蛋白結合率要高于環(huán)氧型載體，可能是由于含有較高的功能基團密度(＞600μmol/g濕載體)。4種載體中，以HA載體效果最好，蛋白結合率及酶活回收率都高于其他3種載體，因此，選擇HA載體作為后續(xù)實驗的固定化載體。

2.2.2 酶用量和固定化時間對共價固定化的影響

平行稱取1g戊二醛活化過的濕載體(含水量70%)8份，分別加入不同量的酶粉，加入4mL的磷酸緩沖液，于25℃固定化18h，測定固定化酶活力(以固定化酶最高酶活力為100%)和酶活回收率，結果如圖3所示。

圖 3 葡聚糖酶用量對固定化效果的影響Fig.3 Effect of glucanase loading on the relative activity and activity recovery of immobilized β-1,3(4)-glucanase

單位質量的載體活性官能團數(shù)量、空間效應和酶的濃度對酶的結合量有重要的影響，因此考察酶用量對固定化效果、節(jié)約酶用量有重要意義。由圖3可知，一定范圍內，隨酶量的增加，蛋白結合量和酶活回收率隨之增加，當1g濕載體，酶用量超過1.2g，即m(酶):m(載體)高于1.2:1時，固定化酶相對活力(蛋白結合量)基本不再增加，但酶活回收率卻逐漸下降，說明載體與酶結合已達飽和狀態(tài)。

2.2.3 溫度對共價固定化的影響

活化載體的醛基與蛋白Lys的ε-NH2在堿性條件下發(fā)生親核加成反應，生成希夫(Schiff)堿，溫度對于希夫堿的形成具有重要的影響，因此，可根據(jù)酶的耐熱性，選擇合適的溫度進行固定化，以縮短固定化時間，選擇1g濕載體，酶用量為1.2g，固定化時間為2h，考察不同溫度下固定化酶的蛋白結合量和酶活回收率，結果見圖4。

圖 4 反應溫度對酶固定化效果的影響Fig.4 Effect of immobilization temperature on the protein binding rate and activity recovery of immobilized β-1,3(4)-glucanase

由圖4可知，本重組葡聚糖酶游離酶在低于50℃以下的溫度范圍內，非常穩(wěn)定，高于70℃，酶失活速率較快[9]。圖中結果顯示，隨溫度升高，蛋白結合量隨之增加，但超過50℃以后，酶活回收率下降，因此，固定化最適溫度可控制在40～45℃之間。另外，溫度過高，副反應較多，因此后續(xù)實驗的固定化溫度選擇40℃。

2.2.4 時間對共價固定化的影響

平行稱取1g戊二醛活化過的濕載體6份，分別加入1.2g酶粉，加入4mL磷酸緩沖液，于40℃固定化不同時間，測定固定化酶活力和酶活回收率，結果見圖5。

圖 5 固定化反應時間對酶固定化效果的影響Fig.5 Effect of reaction time on the relative activity and activity recovery of immobilized β-1,3(4)-glucanase

由圖5可知，固定化8h，固定化酶相對酶活力達到最大，隨后，酶活回收率稍有下降。當溫度控制在25℃固定化時，需要20h 左右才能達到最大結合率(結果未給出)。對于本葡聚糖酶，由于具有良好的熱穩(wěn)定性，因此提高固定化反應溫度，可縮短固定化時間，同時又不影響蛋白結合率(91.7%)(圖中未顯示)和酶活回收率(87.6%)。

2.2.5 固定化酶還原對共價固定化的影響

氨基載體經(jīng)戊二醛活化后與酶蛋白游離氨基形成的希夫堿在水溶液及酸性條件下穩(wěn)定性較差，容易出現(xiàn)蛋白脫落，因此，采用此法固定化的酶需要把C=N形式的雙鍵還原為單鍵的仲胺形式。稱取5g固定化酶，加入20mL KH2PO4-K2HPO4緩沖液(0.02mol/L，pH8.0)，加入4mg/L的NaBH42mL，4℃反應2h，過濾后用磷酸緩沖液沖洗2次。分別稱取1g還原和未還原的固定化酶于10mL酶反應體系(1g/100mL大麥葡聚糖，50mol/L MES，pH7.0)中，50℃反應10min，離心，除去反應物，重復20批次，測定固定化酶活力，以原始固定化酶活力為100%，每個樣品做3次平行。實驗結果表明，還原型固定化酶明顯較未還原的固定化酶穩(wěn)定性高，前者使用20批次后，相對酶活力保持在98%以上，而后者只有75.6%。

2.3 固定化酶性質

2.3.1 pH值對固定化酶的影響

由圖6a可知，固定化酶和游離酶最適pH值沒有發(fā)生變化，都在pH7.0左右，但相對于游離酶，固定化酶在酸性和堿性條件下，對應的酶活要高，且最適作用pH值范圍要寬，在pH5.0～9.0之間，相對酶活力可保持在80%以上，而游離酶在pH6.0～7.5之間。由圖6b可知，不同pH值條件下的穩(wěn)定性表明，固定化酶在pH3.5～10.5之間，相對酶活力保持在80%以上，而游離酶在pH4.5～9.5之間。結果表明固定化酶對pH值的敏感性降低，擴大了pH值應用范圍。

圖 6 固定化酶和游離酶的最適pH值(a)和pH值穩(wěn)定性(b)Fig.6 Optimum pH (a) and pH stability (b) of immobilized and free β-1,3(4)-glucanase

2.3.2 溫度對固定化酶的影響

圖 7 固定化酶和游離酶的最適溫度(a)和熱穩(wěn)定性(b)Fig.7 Optimum temperature (a) and thermal stability (b) of immobilized and free β-1,3(4)-glucanase

由圖7a可知，固定化酶的最適溫度為75℃，較游離酶提高了5℃，且在不同溫度下的相對酶活力高于游離酶。由圖7b可知，固定化酶的耐熱性也高于游離酶，70、75、80℃經(jīng)30min保溫處理后，相對酶活力為88.2%、74.4%和42.6%，而游離酶為80.5%、58.5%和25.2%。

3 結 論

酶的固定化研究中，載體的選擇對固定化成敗具有決定性作用[16-17]，本研究借助于酶分子同源建模，通過對其活性位點及表面氨基酸殘基側鏈分析，在不影響活性位點暴露情況下，選擇酶分子中Lys殘基的ε-NH2作為酶共價交聯(lián)位點，選用氨基型SEPABEADS EC-HA載體，利用戊二醛交聯(lián)雙功能試劑進行固定化，基本實現(xiàn)了酶的定向共價固定化，減少了載體及固定化方法的盲目性。對固定化的條件進行優(yōu)化，得到了m(酶粉):m(載體)=1.2:1、溫度40～45℃、固定化時間8h的最佳固定化條件。固定化酶的最適溫度、熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性均較游離酶有了明顯提高。

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Homology Modeling and Covalent Immobilization of β-1,3(4)-Glucanase from Paecilomyces sp. FLH30

HUA Cheng-wei1，YU Jiang-ao1，XIE Feng-zhen2，CHEN Xiao-jing2
(1. School of Life Science and Technology, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China；2. College of Xinke, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

The three-dimensional structure of β-1,3(4)-glucanase from Paecilomyces sp. FLH30 was constructed by means of homology modeling using the crystal structure of endo-β-1,3(4)-glucanase from Phanerochaete chrysosporium as a template, and its active site and side chains of surface amino acid residues were analyzed. Sepabeads EC-HA as a carrier of amino groups was used for the covalent immobilization of this enzyme and immobilization conditions were optimized. Meanwhile, enzymatic characteristics of free and immobilized β-1,3(4)-glucanase were compared. The best immobilization results were obtained under the conditions: enzyme/carrier mass ratio1.2:1, temperature 40ü45 ℃, and immobilization time 8 h. Under these conditions, the protein binding rate was 91.7% and the activity recovery was 87.6%. The optimum temperature, thermal stability, pH stability and operational stability of immobilized glucanase were all improved when compared to free glucanase.

β-1,3(4)-glucanase；homology modeling；covalent immobilization

Q814.2

A

1002-6630(2013)01-0252-05

2011-10-07

華承偉(1972ü)，男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：hcwxfxhy@yahoo.cn