蘇振霞, 肖 輝, 陳列歡, 柏 春

(1. 淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院 甲殼素研發(fā)中心, 江蘇 連云港 222005)

5種抗生素對嗜水氣單胞菌的抗菌后效應研究

蘇振霞1,2, 肖 輝2, 陳列歡1,2, 柏 春1

(1. 淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇省海洋資源開發(fā)研究院 甲殼素研發(fā)中心, 江蘇 連云港 222005)

采用菌落計數法測定了鹽酸恩諾沙星、鹽酸左氧氟沙星、氧氟沙星等 5種抗生素對嗜水氣單胞菌的抗菌后效應(PAE)。結果顯示, 鹽酸左氧氟沙星、氧氟沙星、鹽酸沙拉沙星、鹽酸恩諾沙星、煙酸諾氟沙星在1×MIC、2×MIC和4×MIC濃度時, 對嗜水氣單胞菌都有抗生素后效應, 并隨著抗生素濃度的增加, 抗菌后效應的時間也延長。

抗生素; 嗜水氣單胞菌; 抗菌后效應

抗菌藥是水產養(yǎng)殖上用于控制感染的不可缺少的藥物, 它的應用使很多感染性疾病得到了有力控制, 但由于不合理的使用抗菌藥物, 導致了不良反應增多, 細菌耐藥性的產生相當嚴重, 故如何合理使用抗菌藥物顯得尤為重要。

抗生素后效應(Postantibiotic effects PAE)指細菌與抗生素短暫接觸后, 在抗生素被清除后, 細菌生長仍受抑制的現象。早在20世紀40年代, 就有人發(fā)現此現象, 但到20世紀70年代, 才由Vogelman與Craig對此現象下了定義。由于PAE對抗生素臨床合理使用具有十分重要的應用價值, 因此日益受到臨床醫(yī)生與學者的重視[1]。有關抗菌藥物 PAE這一新概念目前尚未在水產養(yǎng)殖實踐中應用, 在水產方面關于抗生素后效應的研究也較少, 只有房文紅等[2]在2005年對諾氟沙星和恩諾沙星抗生素后效應進行過研究報道, 蓋春蕾[3]在2008年對二氟沙星對3種海洋弧菌的抗菌后效應進行過研究報道。本課題將研究多種氟喹諾酮類藥物對水產養(yǎng)殖常見病原菌嗜水氣單胞菌的抗菌后效應, 旨在為水產養(yǎng)殖臨床合理用藥和優(yōu)化給藥方案提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品

鹽酸恩諾沙星(純度 99%, 浙江朗博藥業(yè)有限公司); 鹽酸左氧氟沙星(純度90.5%, 浙江普洛康裕制藥有限公司); 氧氟沙星(純度 98.5%, 浙江普洛康裕制藥有限公司); 鹽酸沙拉沙星(純度 98%, 濰坊永興獸藥廠); 煙酸諾氟沙星(純度98 %, 浙江省臺州市東港獸藥有限公司)

1.2 菌種

實驗用嗜水氣單胞菌由淮海工學院海洋學院生物技術實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基: 牛肉膏 3.0 g, 蛋白胨10.0 g, 氯化鈉5.0 g, 水1 000 mL, 制備固體培養(yǎng)基時另加2 %的瓊脂。

1.4 藥液制備

(1)可溶性抗生素藥液制備

準確稱取每一種可溶性抗生素0.02 g, 倒入100 mL無菌雙蒸水, 搖晃直至抗生素溶解, 作為母液放于冰箱中 4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時用液體培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

(2)不溶性抗生素藥液制備

首先配制磷酸鹽緩沖液(pH 6.8), 然后準確稱取每一種不溶性抗生素0.02 g, 倒入100 mL磷酸鹽緩沖液, 搖晃直至抗生素溶解, 作為母液放于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時用液體培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。

1.5 菌懸液制備

將菌種采用平板劃線法接種在平板上培養(yǎng) 1 d,挑取嗜水氣單胞菌菌落在三角燒瓶中進行擴大培養(yǎng)。用溫的液體培養(yǎng)基稀釋到合適濃度。本實驗中菌液濃度為1.35×109cfu/mL。

1.6 最小抑菌濃度(MIC)的測定

采用試管二倍稀釋法[4], 測定5種抗生素對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)。

1.7 抗生素后效應(PAE)的測定

參照蓋春蕾等[3], 房文紅等[2]的方法。

(1) PAE誘導

取2×MIC、4×MIC、8×MIC的抗菌藥液各3 mL與3 mL 1.35×106cfu/mL對數生長期菌懸液置于3支15 mL試管中, 為試驗管(T); 同時設細菌對照管 C,加入6.75×105cfu/mL對數生長期菌懸液6 mL, 此時各管中藥物濃度分別為 1×MIC, 2×MIC, 4×MIC和0×MIC, 即為誘導的藥物濃度, 然后置于 28 ℃恒溫水浴中誘導1 h。

(2) 藥物的除去與重建

取上述各試管及對照管中的菌液0.1 mL分別加至4支9.9 mL 28℃預溫的培養(yǎng)基中重建, 此時為重建后的零時。

(3) 細菌生長動力學曲線建立

于重建后0、1、2、3、4、5、6和8 h分別吸取各管的培養(yǎng)液做系列稀釋, 取0.1 mL于瓊脂平板計數, 重復 3次, 取平均值。以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標,將計數所得的各時間點 cfu/mL值(M)取常用對數(lgM), 以其為縱軸, 繪制對照管及試驗管細菌重建后的生長曲線。

(4) PAE的計算

按公式PAE=T-C計算。其中T、C分別為加藥組、對照組細菌數(cfu/mL)從去除藥物零時開始增加10倍所需要的時間。

1.8 數據處理

PAE數據以 3次試驗結果的平均數±標準差表示。

2 結果

2.1 最小抑菌濃度

表1是5種抗生素對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度。

表1 5種抗生素對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度Tab. 1 The MIC of 5 kinds of antibiotics against Aeromonas hydrophila

由表 1可知鹽酸左氧氟沙星對嗜水氣單胞菌的抑菌效果最好, 最小抑菌濃度為0.012 mg/L, 氧氟沙星、鹽酸沙拉沙星抑菌效果次之, 都為 0.024 mg/L,最后是鹽酸恩諾沙星和煙酸諾氟沙星, 其 MIC為0.098 mg/L。

2.2 5種抗生素對嗜水氣單胞菌的抗生素后效應

圖1～圖5分別是5種抗生素在0 MIC, 1 MIC, 2 MIC, 4MIC作用于嗜水氣單胞菌1 h后的細菌生長曲線。

由圖 1～圖 5可知, 隨著接觸的藥物濃度增大,細菌生長速度在總體上表現出下降趨勢。根據細菌生長曲線計算各組細菌數M(CFU/mL)增加10倍(一個數量級)所需時間, 然后按照PAE計算公式求得各組的PAE, 見表2。

圖1 煙酸諾氟沙星作用于嗜水氣單胞菌后PAE期的細菌的生長曲線Fig. 1 The growth curve of Aeromonas hydrophila in the PAE of Norfloxacin nicotinate

由表2可知, 5種抗生素對嗜水氣單胞菌都產生較明顯的PAE, 并且隨著接觸的藥物濃度增大, PAE也明顯的增加。鹽酸左氧氟沙星、氧氟沙星、鹽酸沙拉沙星、鹽酸恩諾沙星、煙酸諾氟沙星在1×MIC、2×MIC和4×MIC濃度時, 對嗜水氣單胞菌的PAE分別為: 0.25, 1.02, 1.870 h; 0.53, 1.05, 1.61 h; 0.22, 1.44, 1.61 h; 0.69, 1.18, 2.46 h; 0.60, 0.90, 1.71 h。

圖2 鹽酸左氧氟沙星作用于嗜水氣單胞菌后PAE期的細菌的生長曲線Fig. 2 The growth curve of Aeromonas hydrophila in the PAE of Levofloxacin hydrochloride

圖3 氧氟沙星作用于嗜水氣單胞菌后PAE期的細菌的生長曲線Fig. 3 The growth curve of Aeromonas hydrophila in the PAE of Ofloxacin

圖4 鹽酸恩諾沙星作用于嗜水氣單胞菌后PAE期的細菌的生長曲線Fig. 4 The growth curve of Aeromonas hydrophila in the PAE of Enrofloxacin hydrochloride

圖5 鹽酸沙拉沙星作用于嗜水氣單胞菌后PAE期的細菌的生長曲線Fig. 5 The growth curve of Aeromonas hydrophila in the PAE of Sarafloxacin hydrochloride

表2 5種抗生素對嗜水氣單胞菌的PAETab. 2 The PAE of 5 kinds of antibiotics against Aeromonas hydrophila

3 討論

雖然早在20世紀40年代初, 人們已經發(fā)現抗菌后效應現象, 但直到70年代以后人們才開始重視抗生素后效應的研究?？股睾笮?PAE)是近年來在國內外開始引起學術界關注的新理論, 是評價抗生素藥效學的一項新指標, 它是細菌對抗微生物藥敏感性的結構特征性指標, 幾乎是所有抗菌藥物的一種性質。

PAE的一個重要臨床意義就是設計合理的給藥方案, 以便更科學地指導感染性疾病的治療。從藥理學的角度看, 傳統抗生素應用主要依賴于體外細菌對藥物的敏感性(MIC或MBC)與藥物的藥代動力學參數, 常常按 MIC與血藥濃度或感染組織中的藥物濃度來選用藥物、藥物劑量及用藥間隔。理論上, 當血藥濃度低于MIC時, 應再次給藥。由于PAE反映了抗生素消除后或大大低于MIC時細菌的生長仍受到抑制, 故可充分利用PAE的特點來指導合理用藥。PAE已成為確定抗生素劑量與用藥間隔的一個重要參數。對具有明顯PAE的藥物, 最適給藥間隔為血藥濃度超過MIC或MBC的時間加上PAE的持續(xù)時間[5-8]。

關于氟喹諾酮類藥物PAE的研究在國內獸醫(yī)界已有少量研究, 如伍金娥等[9]2003年報道恩諾沙星在8MIC, 4MIC, 2MIC時對金黃色葡萄球菌的PAE為(2.01 ±0.3) h, (1.26 ±0.26) h, (1.01±0.19) h; 對大腸桿菌的PAE為(1.95 ±0.04)h, (1.49±0.13)h, (1.19±0.35) h。諾氟沙星在8MIC, 4MIC, 2MIC時對金黃色葡萄球菌的PAE為(1.61±0.11)h, (0.92±0.28)h, (0.47±0.21) h;對大腸桿菌的 PAE為(1.07±0.17)h, (1.02±0.14)h, (0.7±0.23)h。劉芳萍等[10]2002年報道了單諾沙星對大腸桿菌和金葡球菌的體外抗菌后效應。結果顯示,單諾沙星對大腸桿菌、金葡球菌均有不同程度的較強的PAE, 且PAE值與藥物濃度呈正相關。劉遠飛[11]等2003年報道了單諾沙星和恩諾沙星對大腸桿菌和金葡球菌的抗菌后效應, 并且指出單諾沙星和恩諾沙星對大腸桿菌和金葡球菌均有較明顯的 PAE, 且隨著藥物作用劑量的增大, PAE的時間相應增加。單諾沙星和恩諾沙星在2MIC和4MIC時對大腸桿菌和金葡球菌的PAE比0.5MIC有顯著性(P<0.05)增加。劉滌潔[12]2002年報道了恩諾沙星和環(huán)丙沙星對金葡菌的抗菌后效應及抗菌后亞抑菌濃度效應, 報道指出2、4 MIC的恩諾沙星對金葡菌的PAE為1.03、1.50 h, 1/2、1、2、4 MIC的環(huán)丙沙星的PAE為0.51、0.88、1.47、1.92 h; PAE的大小與藥物濃度呈正相關,且環(huán)丙沙星比恩諾沙星對金葡菌有更長的效應。

本研究結果顯示, 鹽酸恩諾沙星, 煙酸諾氟沙星在4 MIC時對嗜水氣單胞菌都顯示了較長的PAE,特別是鹽酸恩諾沙星的PAE最長。諾氟沙星和恩諾沙星作為水產養(yǎng)殖中常用的氟喹諾酮類藥物, 在制訂水產給藥方案時, 應充分利用其PAE的重要價值,可考慮以血藥濃度高于MIC的時間加上PAE的時間作為給藥間隔, 在滿足療效的基礎上, 不僅能降低生產上可能出現的不良反應, 而且可以達到高效、安全、經濟的治療目的。

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(本文編輯: 康亦兼)

Postantibiotic effects of 5 kinds of antibiotics against bacteriumAeromonas hydrophila

SU Zhen-xia1,2, XIAO Hui2, CHEN Lie-huan1,2, Bai Chun1
(1. Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China; 2. Jiangsu Marine Resources Development Research Insititute, Chitins Research and Development Center, Lianyungang 222005, China)

Dce.,26,2011

Antibiotics;Aeromonas hydrophila; Postantibiotic effect

In this paper, the postantibiotic effects (PAE) of 5 kinds of antibiotics against bacteriumAeromonas hydrophilawere determined by colony counting. The results showed that at the concentrations of 1, 2 and 4 MIC, all these five antibiotics have PAE against bacteriumAeromonas hydrophila, and the time of PAE was prolonged with the increase of as the antibiotics concentrations.

S948

A

1000-3096(2013)01-0092-04

2011-12-26;

2012-03-10

江蘇省海洋資源開發(fā)研究院開放基金(JSIMR10C04); 國家自然科學基金(40906054)

蘇振霞(1978-), 女, 漢族, 山東沂水人, 博士, 副教授, 主要從事水產藥物藥代動力學研究, 電話: 15861247785; E-mail: suzhenxia@sina.com