劉洪軍, 官曙光, 劉清華, 李 軍, 于道德

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

美洲黑石斑精子超低溫保存研究

劉洪軍1, 官曙光1, 劉清華2, 李 軍2, 于道德1

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島 266002; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

作者采用2 mL的冷存管和程序降溫儀高效超低溫保存美洲黑石斑(Centropristis striataL.)精子。分析比較了 4種不同濃度抗凍劑 15%DMSO(二甲基亞砜)、15%EG(乙二醇)、15%PG(丙二醇)和 10% Meth(甲醇), 5種降溫速率(10, 15, 20, 25, 30℃/min)和5種解凍溫度(30, 35, 40, 45, 50℃)對美洲黑石斑精子超低溫保存效果的影響。實驗結(jié)果表明, 采用Hanks’作為稀釋液, 15% DMSO、15% EG、15% PG作為抗凍劑, 30 ℃/min的降溫速率對精液進行超低溫保存35 ℃水浴解凍, 凍精激活后獲得理想的運動率(＞60%)。通過對抗凍劑、降溫速率、解凍溫度的篩選, 作者建立了美洲黑石斑精液高效超低溫保存的方法, 并對凍精進行長期保存。美洲黑石斑精子超低溫保存方法的建立對于海水魚類精子庫的建立以及種質(zhì)資源的保存和生物多樣性的保護具有重要意義。

美洲黑石斑(Centropristis striataL.); 精子低溫保存; 抗凍劑; 精子活力

超低溫冷凍保存是種質(zhì)資源長期保存的一個重要方法。超低溫保存的樣品可進行長距離的運輸, 實現(xiàn)遠緣雜交、異源精子雌核發(fā)育誘導; 同時將精子超低溫保存還可以提高精子的利用率, 減少雄性親魚培育數(shù)量, 降低成本; 通過建立精子庫對精液進行長期保存對種質(zhì)資源保護具有重要意義, 可以使瀕臨滅絕的物種的種質(zhì)細胞得以長期的保存, 待需要時解凍來恢復其資源結(jié)構(gòu)[1-5]。自從 1953年 Blaxter成功冷凍保存大西洋鯡魚(Clupea harengus)精巢[6]以來, 魚類種質(zhì)細胞的低溫保存迅速發(fā)展起來, 在過去的50多年中, 世界許多國家的科研工作者圍繞超低溫保存的降溫方法、抗凍液的篩選、冷凍、解凍速率等方面開展了大量的研究工作, 并取得了巨大的進展, 現(xiàn)已有 200多種魚的精液被成功地超低溫保存起來, 其中有40多種海水魚的精液已進行了成功的超低溫保存研究[7]。中國隨著海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的迫切需要以及對海洋種質(zhì)資源保護的認識, 海洋魚類精液的超低溫保存取得了巨大的進展, 對于一些具有較高的經(jīng)濟價值的魚類的精液如真鯛(Pagrus major)[8-12]、黑鯛(Sparus macrocephlus)[13]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[14]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[15]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[16]、鱸魚(Lateolabrax japonicus)[17]進行了成功的超低溫保存研究。

美洲黑石斑(Centropristis striataL.)屬于鮨科(Serranidae), 石斑魚亞科(Serraninae), 俗名有翡翠斑、珍珠斑等美譽, 屬于目前國際上養(yǎng)殖的石斑魚類之一, 中國于2003年成功引進[18]。黑石斑魚屬于雌雄同體, 首先發(fā)育為卵巢, 至第3～5年精巢開始發(fā)育產(chǎn)生精子。因此黑石斑魚先雌后雄的繁育特性, 給人工繁育帶來了困難。因此為了使得精子、卵子同步獲得, 作者采用了超低溫冷凍保存的方法首先將精子凍存, 然后等待卵子的成熟。目前雖然國外黑石斑精子已有報到[19], 但是僅限于小體積0.5 mL麥管保存, 保存量遠不能滿足生產(chǎn)使用。

本研究中作者擬采用2 mL的凍存管、程序降溫法、分析了4種抗凍劑、5種降溫速率和5種解凍溫度對美洲黑石斑精子超低溫保存的影響。采用程序降溫法, 進行大容量冷凍保存, 建立一種黑石斑魚精子實用型冷凍保存方法。建立美洲黑石斑精子超低溫保存的方法可以減少雄性親魚的養(yǎng)殖量, 從而減少養(yǎng)殖成本, 同時對于石斑魚其他種類精子超低溫保存方法的建立具有重要的指導作用。

1 材料與方法

1.1 精子采集

材料采于2011年采集美洲黑石斑性成熟盛期(3月中旬至 5月下旬), 成熟的親魚養(yǎng)殖于煙臺市百佳水產(chǎn)公司(龍口, 黃山館養(yǎng)殖基地)。10尾雌魚和 20尾雄魚(3～4 kg, 6～7 齡)暫養(yǎng)于20 m3水池中, 循環(huán)海水。精子采集前雄魚首先置于0.003% 的丁香酚溶液中麻醉, 然后取出將魚體用蒸餾水沖洗、擦干, 輕輕擠壓腹部采集精液于玻璃器皿中, 采集過程中注意海水、血液、糞便的污染。收集的精子立即進行鏡檢, 活力較高的精子進行下面的試驗。

1.2 抗凍劑的篩選

將精液與Hanks’液(NaCl 8.01 g/L; KCl 0.40 g/L; CaCl20.14 g/L; NaHCO30.35 g/L; KH2PO40.06 g/L; MgCl·6H2O 0.10 g/L; MgSO4·7H2O 0.10 g/L; Na2HPO4·2H2O 0.06 g/L; Glucose 10.00 g/L; pH 6.80)稀釋的不同種類不同濃度的抗凍劑: 二甲基亞砜 (DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇 (PG)、甲醇(Meth) 以1∶3(v/v)的比例混合后, 將混合液吸入2 mL的冷存管中, 然后將冷存管轉(zhuǎn)入Kryo-360-1.7程序降溫儀, 0 ℃平衡2 min,置于程序降溫儀中, 平衡, 然后以 20 ℃/min 的速度降至–180℃并停留2 min, 然后轉(zhuǎn)入液氮保存。保存一定的時間然后解凍激活, 計算精子的運動率。實驗中運動率的計算是采用精子激活后視野中運動的精子占所有精子的百分比, 一個樣品取3個視野, 一個視野精子數(shù)不低于100個。

1.3 降溫速率的篩選

將精液與Hanks’液稀釋的DMSO以1:3的比例混合后, 0 ℃平衡 2 min, 置于程序降溫儀中平衡, 然后以10、15、20、25、30℃/min 的速度降至–180℃并停留2 min, 然后轉(zhuǎn)入液氮保存。4個月后以35℃水浴解凍計算運動率。每個實驗均重復3次。

1.4 解凍溫度的篩選

將精液與Hanks’稀釋的DMSO以1∶3的比例混合后, 置于程序降溫儀中, 以不同的降溫速率進行冷凍處理, 然后保存于液氮中, 4個月后以35℃水浴解凍計算運動率。每個實驗均重復3次。

1.5 解凍方法的篩選

將精液與 Hanks’液稀釋的不同種類的抗凍劑以1∶3的比例混合后, 置于程序降溫儀中, 平衡2 min,然后以20℃/min的速度降至–180℃并停留2 min, 最后快速轉(zhuǎn)入液氮中進行超低溫保存。保存 4個月后分別以 30、35、45、45、50℃水浴解凍, 計算運動率。每個實驗均重復3次。

1.6 凍精活力持續(xù)時間

將精液與Hanks’稀釋的15%DMSO、15%EG、15%PG以 1∶3的比例混合后, 置于程序降溫儀中,以–30℃/min的降溫速率進行冷凍處理, 然后保存于液氮中, 4個月后以35℃水浴解凍計算運動率。每個實驗均重復3次。

1.7 統(tǒng)計分析

用SPSS 11.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用平均值±SD表示, 用一元方差分析(ANOVA)進行差異比較, 并運用 SNK(Student-Newman-Keuls’test)分析法進行顯著性檢驗, 當P＜0.05認為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 抗凍劑對凍精運動率的影響

抗凍劑對凍精運動率的影響如圖 1所示, 采用15% DMSO、15% EG、15% PG作為抗凍液保存的精子解凍后活力分別為(61.2±6.8)%、(56.6±9.1)%、(64.7±7.4)%, 雖然顯著低于對照(新鮮精子)的運動率,但它們之間的差異并不顯著。相對而言10% Meth保存的凍精的運動率較差, 顯著低于其他抗凍劑(P<0.05)。因此作者確定了15% DMSO、15% EG、15% PG都可作為美洲黑石斑精子冷凍保存的抗凍劑。

圖1 不同抗凍劑對凍精運動率的影響Fig. 1 Effect of different cryoprotectant on post-thaw sperm motility

2.2 降溫速率對凍精運動率的影響

降溫速率對凍精運動率的影響如圖 2所示, 將15% DMSO保存的凍精, 以10、15、20、25、30℃/min的降溫速率保存的凍精激活后其運動率并沒有顯著的差異(P＞0.05), 但相對于對照(新鮮精子)還是顯著降低(P＜0.05)。因此為了節(jié)省時間作者確定了30℃/min作為美洲黑石斑精子超低溫冷凍保存的降溫速率。

圖2 不同降溫速率對凍精運動率的影響Fig. 2 Effect of different cooling rate on post-thaw sperm motility

2.3 解凍溫度對精子運動率的影響

將15%DMSO保存的凍精, 分別以30、35、40、45、50℃的水浴解凍, 水浴溫度對精子的運動率的影響見圖 3。結(jié)果顯示 30、35、40、45、50℃水浴解凍后的凍精的運動率間沒有顯著的差異(P> 0.05),但相對于對照(新鮮精子)還是顯著降低(P< 0.05)。鑒于實驗操作的方便性, 因此作者確定 35℃作為美洲黑石斑凍精的解凍溫度。

圖3 不同解凍溫度對凍精運動率的影響Fig. 3 Effect of different thaw temperature on post-thaw sperm motility

2.4 凍精激活后活力持續(xù)時間

15%DMSO、15%EG、15%PG以30℃/min的降溫速率保存的凍精, 35℃水浴解凍后, 海水激活后活力狀況與激活時間的關(guān)系見圖 4。凍精活力在 15 s之內(nèi)急速下降, 15 s時凍精的運動率只有剛剛激活時的1/3。冷凍精子活力持續(xù)的時間與鮮精比差異不顯著(P＞0.05), 但是活力下降速度明顯比鮮精快。

圖4 激活時間對凍精與凍精運動率的影響Fig. 4 The effect of activation time on post-thaw sperm motility

3 討論

適宜的抗凍劑是魚類精子保存成功的關(guān)鍵因素,不同的抗凍劑對不同種魚的精液保護作用差異很大。因此建立精子冷凍保存方法的首要因素是篩選最適宜的抗凍劑的種類及濃度。參考課題組之前對真鯛、大菱鲆、大黃魚等海水魚類冷凍保存的方法以及黑石斑魚精子的生理學特性, 作者確定了15%DMSO、EG%%、15%PG以及10%Meth作為主要的幾種抗凍劑進行篩選。在美洲黑石斑精子超低溫保存中作者發(fā)現(xiàn)15% DMSO、15% EG、15% PG獲得了較好的保護效果。在DeGraaf[19]等報道0.5 mL的麥管冷凍的黑石斑魚精子采用10%DMSO也獲得了較好的保存效果。DMSO由于其具有較好的滲透性是魚類精子超低溫保存應(yīng)用最為廣泛的一種抗凍劑, 5%～20% DMSO在許多海水魚類精子的超低溫保存種都取得了令人滿意的效果, 例如, 金頭鯛(Sparus aurata)[20]、細須石首魚(sciaena russelli)[21]和大菱鲆[15,22]。在大黃魚精子超低溫保存中 10% DMSO也表現(xiàn)出較好的保護效果。EG、PG也是滲透性較好的抗凍劑在真鯛[8]精子超低溫保存中也獲得了較好的保存效果。但是對于大黃魚精子EG、PG作為保護劑冷凍的精子其運動率一般。然而PG、EG在細須石首魚[14,21], 金頭鯛[20]精子的超低溫保存取得了理想的運動率和受精率。在真鯛精子超低溫保存中DMSO、EG、PG也獲得了較好的保存效果[8-12,14]。但是 Meth 對美洲黑石斑的精子的保護效果較差,同樣在大黃魚[14]、真鯛[8]精子超低溫保存中也表現(xiàn)出較差的保存效果, 一些學者認為這是由于Meth過強的毒性和滲透性造成的, 這也是實驗中Meth選擇10%而不是15%的原因。因此抗凍劑種類以及濃度對精子的保護效果具有較強的魚的種的特異性, 因此適宜抗凍劑及其濃度的選擇是魚類精子成功保存的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

降溫速率和解凍溫度對魚類精子的超低溫保存有重要作用。冷凍、解凍過程都會造成精子遭受結(jié)晶或者重結(jié)晶的損傷。但是對于美洲黑石斑精子, 10～30 ℃/min的降溫速率、30～50℃水浴解凍溫度對冷凍解凍后的精子活動率沒有明顯的影響。解凍溫度過低會導致解凍時間較長, 而解凍溫度過高則影響操作的方便性, 因此在試驗中作者選擇了 35℃水浴解凍。在大黃魚精液超低溫保存中作者發(fā)現(xiàn) 43℃水浴解凍其運動率明顯地高于 28℃水浴解凍[14], 然而在另一大黃魚精液冷凍保存實驗林丹軍[23]等卻發(fā)現(xiàn)室溫解凍要優(yōu)于38～40℃水浴解凍。有文獻[24]報道解凍溫度的選擇應(yīng)取決于降溫速率, 以避免解凍過程中重結(jié)晶的形成。

作者首次采用程序降溫法成功地超低溫保存美洲黑石斑精液, 獲得了較為理想的保存效果, 并將冷凍的精子長期保存于中國科學院海洋研究所海洋動物種質(zhì)庫。通過實驗作者建立了美洲黑石斑精液高效、系統(tǒng)、完整超低溫保存的方法, 此方法的建立對海水魚類種質(zhì)資源的保存和生物多樣性的保護具有重要意義。

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(本文編輯: 譚雪靜)

An efficient methodology of sperm cryopreservation inCentropristis striata

LIU Hong-jun1, GUAN Shu-guang1, LIU Qing-hua2, LI Jun2, YU Dao-de1
(1. Mariculture Institute of Shandong Province, Qingdao 266002, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Sept.,21, 2011

Centropristis striata; cryopreservation; cryoprotectant; sperm motility

In the present study,Centropristis striatasperm was efficiently cryopreserved using a programmable freezer. The motility of both fresh and post-thaw sperm was investigated in order to optimize the sperm cryopreservation protocols forC. striata. Four cryoprotectants (15% dimethyl sulfoxide, 15% ethylene glycol, 15% propylene glycol and 10% methanol), five cooling rates (10, 15, 20, 25 and 30℃/min) as well as five thawing temperatures (30, 35, 40, 45 and 50 ℃) were designed and tested in the sperm cryopreservation, and their effects on post-thaw sperm motility were studied. Optimal post-thaw motility (>60%) were achieved when using Hanks’s supplemented with 15% DMSO, 15% PG and 15% EG with 30℃/min cooling rate, and 35℃ water bath. An efficient cryopreservation method forC. striatasperm was established by analyzing the effect of cryoprotectants, cooling rates and thaw temperatures. This method is advantageous not only to establish laboratory experiment but also to preserve genetic resources for routine aquaculture hatchery operation.

Q331

A

1000-3096(2013)01-0076-05

2011-09-21;

2011-12-06

農(nóng)業(yè)部 948項目(2011-Z39); 中國科學院海洋研究所知識創(chuàng)新工程領(lǐng)域前沿項目(Y02507101Q); 國家自然科學基金資助項目(41076100, 31072212)

劉洪軍(1964-), 男, 山東博興人, 研究員, 主要從事海洋生物學研究, 電話: 0532-82655169, E-mail: hongjunl@126.com;于道德,通信作者, E-mail: wensentte@163.com