姜會(huì)超, 田 黎, 史振平 張久明

(1.青島科技大學(xué), 山東青島 266042; 2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所, 山東青島 266061)

膠州灣海域PAHs污染與可培養(yǎng)半知菌的多樣性

姜會(huì)超1,2, 田 黎1,2, 史振平1, 張久明1

(1.青島科技大學(xué), 山東青島 266042; 2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所, 山東青島 266061)

用5種不同的培養(yǎng)基對(duì)膠州灣近岸污染環(huán)境可培養(yǎng)半知菌進(jìn)行選擇性分離, 共得到235株半知菌, 其中YM培養(yǎng)基、MPDA培養(yǎng)基對(duì)半知菌的分離效果最好, 分別占分離總量的26.4%和24.7%。試驗(yàn)選擇的3個(gè)站位: 石老人潮間帶、海泊河入海口、李村河入?？赑AHs含量存在顯著性差異(P＜0.05),其中石老人最低, 平均為 113.8 ng/g, 海泊河 PAHs為 324.9 ng/g, 介于中等水平, 李村河含量最高為882.1 ng/g?？膳囵B(yǎng)半知菌群體隨PAHs含量的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。對(duì)各站位的半知菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn), 污染不同的站位, 可培養(yǎng)半知菌優(yōu)勢(shì)種群不同, 說(shuō)明PAHs的污染可對(duì)半知菌的菌落結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生影響。

膠州灣; PAHs; 半知菌

多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是一類(lèi)廣泛存在于環(huán)境中具有“三致作用”(致癌、致畸、致突變)的有機(jī)污染物, 環(huán)數(shù)越高的PAHs對(duì)環(huán)境的危害相對(duì)越大[1]。PAHs以水體中的懸浮物為主要載體, 進(jìn)入海洋環(huán)境后由于難溶于水而不斷累積于沉積物中, 海洋沉積物中的 PAHs的積累量占沉積物中難降解污染物總量的 97%以上, PAHs可通過(guò)食物鏈的富集作用對(duì)高等生物以及人類(lèi)健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[2-3]。目前化學(xué)分析的方法可以較準(zhǔn)確地測(cè)試海洋中的PAHs含量, 但不同PAHs含量對(duì)海洋生物種群的影響很少見(jiàn)有報(bào)道。半知菌是海洋環(huán)境分布較廣的一類(lèi)真核微生物, 環(huán)境污染對(duì)其優(yōu)勢(shì)種群結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生較直觀的影響, 而優(yōu)勢(shì)種群的變化能夠在一定程度上指示環(huán)境的污染狀況[4-5]。目前尚未見(jiàn)有海洋環(huán)境 PAHs污染與半知菌關(guān)系的研究報(bào)道,本文選擇污染比較典型的膠州灣作為試驗(yàn)海域, 通過(guò)對(duì)可培養(yǎng)半知菌的選擇性分離, 獲得該海域半知菌分離較適合的分離方法, 對(duì)污染程度不同的采樣站位的半知菌種群進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 探討半知菌種群結(jié)構(gòu)對(duì)PAHs污染的反映。

1 材料與方法

1.1 站位的確定與樣品采集

根據(jù)課題組以往調(diào)查, 膠州灣海域的李村河(LC)入?？?36°09′N(xiāo), 120°21′E)、海泊河(HB)入海口(36°06′N(xiāo), 120°19′E)、石老人(SL)潮間帶(36°04′N(xiāo), 120°27′E) 分別定為重度、中度污染區(qū)和輕度污染區(qū)的采樣站位, 采樣以各入?？跒橹行?、根據(jù)采樣地形間隔 30 m 為一采樣點(diǎn), 取不同沉積物表層(0～20 cm), 共取得12個(gè)樣品(石老人4個(gè), 海泊河4個(gè),李村河4個(gè)), 每個(gè)樣品由該采樣點(diǎn)隨機(jī)取的3個(gè)樣混合組成。樣品分為兩份, 一份裝入預(yù)清洗的棕色玻璃瓶中用于 PAHs測(cè)定, 一份用于半知菌的分離培養(yǎng)。

1.2 PAHs測(cè)定

PAHs測(cè)定參照薛荔棟等[6]的方法, 并作適當(dāng)修改:

樣品經(jīng)冷凍干燥后研磨通過(guò)80目篩網(wǎng)并混勻。稱取篩分混勻樣品 10 g, 與 10 g無(wú)水硫酸鈉混合,利用正己烷和丙酮混合試劑(體積比為 1∶1)索氏提取16～24 h。 提取過(guò)程中加入高純銅粉脫硫,旋蒸氮吹濃縮至2～3 mL,加入50 mL正己烷替換溶劑, 然后濃縮至近干再加入2 mL正己烷。 濃縮提取液通過(guò)硅膠/氧化鋁(體積比為 1∶2)層析柱(柱頂部填充適量無(wú)水硫酸鈉和高純銅粉), 再加入40 mL 正己烷淋洗棄去飽和烷烴。此后, 加入80 mL混合溶劑(二氯甲烷+正己烷, 體積比 3∶7)洗脫得到 PAHs組分,經(jīng)旋蒸氮吹濃縮至1mL。

PAHs組分采用配有 6890N型氣相色譜儀和5975B型質(zhì)譜檢測(cè)器的 Agilent GC-MS進(jìn)行分析。GC/MS條件: 進(jìn)樣口溫度是250℃, 柱初始溫45℃,保持1 min, 以6℃/min程序升溫至200℃, 然后以8℃/min程序升溫到300℃, 并保持5 min。載氣為氦氣, 流量1.0 mL/min。不分流進(jìn)樣, 進(jìn)樣量為1μL。毛 細(xì) 管 柱 : HP-5MS(Agilent 19091S-433)30.0 m×250.0μm×0.25μm。質(zhì)譜條件: 電子轟擊離子源模式, 離子源溫度為 200℃, 接口溫度 280℃, 電子轟擊能量70 eV, 選擇離子掃描(SIM)方式[7-8]。

1.3 半知菌培養(yǎng)基

海水馬鈴薯(MPDA)培養(yǎng)基, 燕麥片 ( YM)培養(yǎng)基[9-10], 查氏(CA)培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基、孟加拉紅(MJ)培養(yǎng)基、用于真菌分離[11-12]。

為了抑制細(xì)菌的干擾, 每種培養(yǎng)基均加入終濃度為50 mg/L的鏈霉素。

1.4 半知菌分離方法

稱取沉積物樣品5 g, 在無(wú)菌操作下加入盛有50 mL體積分?jǐn)?shù)為50%無(wú)菌人工海水的三角瓶中, 用渦旋振蕩器充分振蕩均勻后, 于200 r/min搖床振蕩10 min后靜置取上清液5 mL, 加入裝有45 mL同樣鹽分無(wú)菌人工海水的三角瓶中, 倍半法稀釋使樣品終濃度為10-4、10-5。分別取100 μL涂布在5種不同的培養(yǎng)基上, 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

將上述分離平板置于25℃恒溫培養(yǎng), 5～15 d, 從培養(yǎng)平板內(nèi)挑取菌落形態(tài)和色素不同單細(xì)胞的菌落,做好統(tǒng)計(jì)以便進(jìn)行不同培養(yǎng)基分離效果的比較。對(duì)所分離到的半知菌再根據(jù)菌株生物學(xué)與分子生物學(xué)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn), 確定半知菌的種屬。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,并用duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 PAHs測(cè)定結(jié)果

表1 沉積物樣品PAHs含量測(cè)定結(jié)果(ng/g)Tab. 1 Concentration of PAHs in surface sediment in different sampling sites(ng/g)

石老人、海泊河、李村河各站位沉積物中16種優(yōu)先監(jiān)控的多環(huán)芳烴含量測(cè)定結(jié)果如表1所示。

對(duì)各采樣點(diǎn)PAHs總量進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 結(jié)果如圖1所示, 通過(guò)表 1及圖 1我們可以看出, 石老人站位PAHs污染種類(lèi)少且含量低, 四個(gè)采樣點(diǎn)PAHs總量平均值為113.8 ng/g, 海泊河站位PAHs污染物種類(lèi)比石老人站位多, 除萘未檢出外, 其他 14種 PAHs污染物均可檢測(cè)到, 4采樣點(diǎn)總量平均值為 324.9 ng/g, 是石老人站位的 2.9倍; 李村河入?？谡疚籔AHs污染物種類(lèi)和每種污染物的含量在3個(gè)試驗(yàn)區(qū)最高, 同時(shí)該4采樣點(diǎn)PAHs總量波動(dòng)較大, 最低為327.8 ng/g, 最高為1367.8 ng/g, PAHs總量平均值為 882.1 ng/g, 分別是石老人站位的 7.8倍, 海泊河站位的2.7倍。從各站位PAHs的組成看, 石老人站位PAHs污染主要以3環(huán)為主, 含量占50%左右。李村河與海泊河站位 4～5環(huán)多環(huán)芳烴所占比例較大,含量占60%以上, 對(duì)環(huán)境的危害較大。

圖1 各采樣點(diǎn)PAHs總量Fig. 1 Contents of PAHs in different sampling sites

2.2 不同培養(yǎng)基分離效果比較

采用CA、MPDA、YM、WA、MJ5種培養(yǎng)基對(duì)石老人、海泊河、李村河三個(gè)站位共12個(gè)樣品進(jìn)行分離, 對(duì)每種培養(yǎng)基在每個(gè)采樣點(diǎn)分離到的半知菌菌株數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 結(jié)果如表2所示。

5種培養(yǎng)基在12個(gè)采樣點(diǎn)共分離到235株半知菌, 其中YM培養(yǎng)基、MPDA培養(yǎng)基分離到半知菌的數(shù)量最多, 分別分離到62株、58株, 總共占到分離總量51%。其次是CA和WA培養(yǎng)基, 分別分離到47株、40株, MJ培養(yǎng)基分離到的半知菌數(shù)量最少,只分離到28株。

表2 不同培養(yǎng)基選擇分離半知菌結(jié)果Tab. 2 Statistics of Deuteromycetes species from different isolation medium

對(duì)5種培養(yǎng)基的分離結(jié)果進(jìn)行方差分析, 5種培養(yǎng)基的分離效果存在顯著性差異(P＜0.05), 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為進(jìn)一步探討各培養(yǎng)基的分離效果, 對(duì)其進(jìn)行多重比較, 結(jié)果如表3所示。

由表3可知, YM培養(yǎng)基分離效果最好, 分離到的半知菌種類(lèi)數(shù)比MJ培養(yǎng)基提高了124%, 其次是MPDA、CA、WA培養(yǎng)基, 分離效果分別比MJ培養(yǎng)基提高了108%、70%、43%。MJ培養(yǎng)基分離效果最差。

表3 不同培養(yǎng)基半知菌分離結(jié)果多重比較Tab. 3 Multiple comparison of Deuteromycetes species amount from different isolation medium

2.3 不同站位半知菌分布結(jié)果

2.3.1 不同站位半知菌菌落總數(shù)分布結(jié)果

對(duì)石老人、海泊河以及李村河三個(gè)站位, 12個(gè)采樣點(diǎn)的半知菌菌落總數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 結(jié)果如表4所示。

由表4可以看出, 從站位上分析, 半知菌菌落總數(shù)在石老人、海泊河、李村河三個(gè)站位上表現(xiàn)出明顯的差異(P＜0.05)。半知菌菌落總數(shù)在石老人輕度污染區(qū)比較低, 為 7.7×105cfu/g。在海泊河中度污染區(qū)半知菌菌落總數(shù)含量最高, 達(dá)到2.2×106cfu/g。到李村河重度污染區(qū)半知菌菌落總數(shù)降低到 1.3× 106cfu/g。半知菌菌落總數(shù)隨著 PAHs污染程度的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。

表4 半知菌菌落總數(shù)結(jié)果 (105cfu/g)Tab. 4 Total amount of Deuteromycetes in different sampling site(105cfu/g)

2.3.2 不同站位半知菌種類(lèi)分布結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì)分離的235株半知菌分類(lèi)鑒定, 得到25種不同種屬的半知菌, 其中青霉 11種(Penicilliumsp.),曲霉8種(Aspergillussp.), 枝霉(Cladosporiumsp.)、鐮孢霉(Fusariumsp.)、交鏈孢霉屬(Alternariasp.)、紅絲菌疣孢霉(Mycogone rosea)、單孢霉屬(Monosporiumsp.)、木霉(Richodermasp.)各一種。對(duì)半知菌在每個(gè)站位的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 結(jié)果如圖2所示。

圖2 半知菌三站位分布Fig. 2 Distributions of Deuteromycetes in different sampling sites.

由圖2可知, 團(tuán)青霉(Penicillium commune)、黃青霉(Penicillium chrysogenum)、灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)這3種半知菌在石老人、海泊河、李村河3個(gè)站位分布比較普遍, 屬于優(yōu)勢(shì)種。污染輕的石老人海域還分布有特異青霉(Penicillium notatum)、小刺 青 霉 (Penicillium spinulosum)、 瓶 梗 青 霉(Paecilomyces Bainier)、殼青霉(Penicillium crustosum)、木霉(Richodermasp.)等, 顯示良好的半知菌多樣性; 擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、交鏈孢霉屬(Alternariasp.)棒曲霉(Aspergillus clavatus)、紅絲菌疣孢霉屬(Mycogone rosea)、單孢霉屬(Monosporiumsp.)薩氏曲霉(Aspergillus sydowi)在污染較重的海泊河、李村河分布較多, 其中棒曲霉(Aspergillus clavatus)、紅絲菌疣孢霉屬(Mycogone rosea)以及單孢霉屬(Monosporiumsp.)只出現(xiàn)在海泊河輕度污染區(qū), 薩氏曲霉(Aspergillus sydowi)只出現(xiàn)在李村河重度污染區(qū)。

3 討論

膠州灣的海泊河入海口、李村河入海口流經(jīng)青島市主要的重工業(yè)區(qū), 沿岸居民區(qū)密布, 匯集大量城市廢水廢物, 對(duì)周?chē)h(huán)境和生物群體結(jié)構(gòu)造成較大影響。課題組以往有關(guān)該區(qū)域的重金屬、氮磷的調(diào)查顯示, 石老人、海泊河、李村河三站位污染級(jí)別由輕到重[4],本文的PAHs含量也表現(xiàn)相同趨勢(shì)。目前對(duì)于海洋 PAHs污染等級(jí)的劃分還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn), 國(guó)內(nèi)外研究大多采用1995年Long等[13-14]提出的L-ER-M效應(yīng)評(píng)估法。按照此評(píng)估法, 采樣的3個(gè)站位PAHs含量尚未超過(guò)最低危害值。但已引起半知菌菌落結(jié)構(gòu)的較明顯變化, 除了其他污染物的綜合效應(yīng)外, PAHs對(duì)生物的危害不容忽視。

目前對(duì)微生物多樣性的評(píng)估不少研究都使用分子生物學(xué)手段, 但可培養(yǎng)種類(lèi)涉及該生境微生物的進(jìn)一步利用, 如污染指示、污染降解等, 在環(huán)境調(diào)查與研究中也是必不可少, 污染海洋環(huán)境半知菌的分離與調(diào)查, 國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道,

本研究進(jìn)行了有益的探索, 獲得的結(jié)果證明: YM 培養(yǎng)基對(duì)半知菌的分離效果最好, 分離到的半知菌種類(lèi)最為豐富, 不但將樣品中廣泛存在的團(tuán)青霉(Penicillium commune)、黃青霉(Penicillium chrysogenum)、灰黃青霉(Penicillium griseofulvum)等優(yōu)勢(shì)種分離出來(lái), 還獲得小刺青霉(Penicillium spinulosum)、瓶梗青霉(Paecilomyces Bainier)等海洋環(huán)境少見(jiàn)的種, 利用優(yōu)勢(shì)種研究對(duì)環(huán)境指示作用的研究正在進(jìn)行中。

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(本文編輯: 張培新)

Culturable deuteromycetes diversity and PAHs contamination in Jiaozhou bay

JIANG Hui-chao1,2, TIAN Li1,2, SHI Zhen-ping1, ZHANG Jiu-ming1
(1. Qingdao University of Science & Technology, Qingdao 266042, China; 2.The First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, China)

May,11,2012

Jiaozhou bay; PAHs; deuteromycetes

Five different kinds of culture medium were used to selectively isolate culturable Deuteromycetes in contaminated coast of Jiaozhou bay and 235 strains of Deuteromycetes were obtained. Among the medium, YM and MPDA isolated Deuteromycetes the best. The isolate rates of the total isolated-strains of YM and MPDA were 26.4% and 24.7%, respectively. PAHs contents among the three sampling sites manifested significant difference (P＜0.05) with the lowest in Shilaoren tidal zone (average 113.8ng/g), moderate in Haibo River estuary (average 324.9 ng/g) and the highest in Licun River estuary (average 882.1ng/g). On the basis of the changes of PAHs contents in different sites, with the increase of PAHs amount, the amount of culturable Deuteromycetes increased in certain degree and then decreased. Further research showed that the dominant species differed in the three sites with different PAHs contents which indicated PAHs contamination might exert effect on the composition of Deuteromycetes colony.

X55

A

1000-3096(2013)05-0033-06

2012-05-11 ;

2012-06-02

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAE06B04); 國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA10A202-2, 2011AA09070402); 海洋公益項(xiàng)目(201005032-2)

姜會(huì)超(1984-), 男, 山東青島人, 碩士, 主要從事海洋微生物的研究, E-mail: jianghuichao2008@163.com; 田黎, 通信作者,電話:86-532-88967423, E-mail: wshw8@yahoo.com.cn