高立新(濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院，河南 濮陽(yáng) 457001)

山銀花不同物候期總皂苷的含量測(cè)定

高立新(濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院，河南 濮陽(yáng) 457001)

目的 建立山銀花藥材中總皂苷含量測(cè)定方法。方法 采用分光光度法，以香草醛-高氯酸為顯色劑，在477 nm處測(cè)定不同物候期山銀花藥材中總皂苷的含量。結(jié)果 灰氈毛忍冬皂苷乙在0.501～6.012 μg·mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為100.1%。山銀花花蕾不同發(fā)育期樣品中總皂苷含量差異明顯，以灰氈毛忍冬皂苷乙計(jì)，總皂苷含量在8.00%～21.41%內(nèi)均有分布。結(jié)論 山銀花整個(gè)花期皂苷類成分差異明顯，其中銀花期含量最高，米蕾期最低。本實(shí)驗(yàn)為山銀花藥材的采收加工提供了數(shù)據(jù)支撐。

山銀花；總皂苷；灰氈毛忍冬皂苷乙；比色法

山銀花Lonicerae Flos為忍冬科植物灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand-Mazz.)、紅腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)、華南忍冬(Lonicera Confuse DC.)或黃褐毛忍冬(Lonicera fulvotomentosa Hsu et S. C. Cheng.)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功效，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等[1-2]。2010年版中國(guó)藥典將山銀花與金銀花分列，并在藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下收載了以綠原酸[3]、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙為評(píng)價(jià)指標(biāo)的定量分析方法。關(guān)于金銀花花蕾在不同發(fā)育期有效成分動(dòng)態(tài)變化多有報(bào)道[4-7]，山銀花花蕾在不同發(fā)育期的研究相對(duì)較少。本研究以總皂苷為指標(biāo)，比較山銀花花蕾不同發(fā)育期皂苷含量的差異。

1 儀器與試藥

對(duì)照品灰氈毛忍冬皂苷乙(自制，HPLC面積歸一化法純度≥98%，經(jīng)波譜分析鑒定結(jié)構(gòu))。

山銀花樣品采自湖南，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院代麗萍副教授鑒定為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand-Mazz.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。

T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Sartorius型電子天平(德國(guó)賽多利斯)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山超聲儀器科技有限公司)；所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

準(zhǔn)確移取0.1 mL灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品溶液、50 μL山銀花甲醇提取液，分別置于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，再加入高氯酸0.6 mL，密塞、搖勻，于65 ℃水浴中加熱20 min，立即取出用流水冷卻至室溫，加入冰醋酸5 mL稀釋，搖勻。350～800 nm內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以不加對(duì)照品和供試品的樣品管為空白。對(duì)照品和供試品溶液在477 nm處均有最大吸收，確定山銀花中總皂苷的測(cè)定波長(zhǎng)為477 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品灰氈毛忍冬皂苷乙適量，甲醇溶解并定容，得濃度為0.501 mg·mL-1的灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

稱取干燥的山銀花樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.1 g，精密稱定，置入錐形瓶中，加入甲醇25 mL，超聲處理45 min，冷卻至室溫，甲醇補(bǔ)充損失的重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液50 μL，置于10 mL具塞試管中， 按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10，20，40，60，90，120 μL，置10 mL具塞試管中，以試劑溶液作為參比，按“2.1”項(xiàng)下顯色條件操作，在477 nm處分別測(cè)定吸收值(A)，以吸收值為縱坐標(biāo)，含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y= 0.183 8X+0.019，r=0.998，結(jié)果表明灰氈毛忍冬皂苷乙在0.501～6.012 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品溶液30 μL，共5份，分別置于10 mL具塞試管中，按上述顯色條件操作，測(cè)定吸光度，其RSD為0.33 %。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取干燥的山銀花粉末約1 g，共6份，精密稱定，以試劑溶液作為參比，按“2.3”項(xiàng)下方法提取，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，以灰氈毛忍冬皂苷乙計(jì)，總皂苷平均含量為8.92 %，RSD為2.01 %。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取干燥的山銀花粉末約1 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法提取、顯色，分別于顯色后0，1，2，3，4 h測(cè)定吸光度，RSD為0.60%，表明處理后的樣品在顯色后4 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱量已知含量的山銀花樣品約0.05 g，共9份，精密稱定，分別加入濃度為0.501 mg·mL-1灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品溶液適量(濃度為樣品濃度的80%、100%、120%)，按“2.3”項(xiàng)下方法提取，按“2.1”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率為100.1%，RSD為1.14%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 灰氈毛忍冬皂苷乙加樣回收率Tab 1 The recoveries of macranthoidin B

2.9 樣品測(cè)定

稱取各樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法提取，測(cè)定吸光度，以灰氈毛忍冬皂苷乙計(jì)，計(jì)算各樣品中總皂苷含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同發(fā)育期山銀花樣品中總皂苷的含量Tab 2 The contents of total triterpenoid saponin in Lonicerae Flos at different developmental stages

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了山銀花藥材中總皂苷的含量測(cè)定方法，并測(cè)定了6個(gè)不同發(fā)育期山銀花樣品中總皂苷的含量。結(jié)果表明山銀花花蕾不同發(fā)育期樣品中總皂苷含量差異顯著，以灰氈毛忍冬皂苷乙計(jì)，總皂苷含量在8.00%～21.41%內(nèi)均有分布，其中銀花期含量最高，米蕾期含量最低。不同年份采集的山銀花樣品相比，總皂苷含量略有差異，但6個(gè)發(fā)育期的變化趨勢(shì)一致。

在供試品溶液制備方法考察過(guò)程中，曾考察總皂苷在提取過(guò)程中是否需要石油醚脫色脫脂，結(jié)果表明，石油醚萃取對(duì)總皂苷測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著影響；而用水飽和的正丁醇萃取富集總皂苷時(shí)，總皂苷損失較大，并且乳化嚴(yán)重，因此，選擇溶劑超聲提取后提取液直接進(jìn)行顯色反應(yīng)，并對(duì)提取溶劑、超聲時(shí)間、溶劑用量等進(jìn)行單因素考察，甲醇與乙醇相比，甲醇提取效果較好；超聲30，45，60 min的比較結(jié)果表明，45，60 min相當(dāng)，均優(yōu)于30 min的提取效果；溶劑用量分別考察了20倍、25倍和30倍體積，25倍體積時(shí)提取率最高。因此，最終確定山銀花藥材中總皂苷的提取工藝為甲醇25 mL，超聲提取45 min。

采用比色法測(cè)定總皂苷時(shí)常用的顯色劑有香草醛-高氯酸、茴香醛-濃硫酸和對(duì)二甲氨基苯甲醛等，實(shí)驗(yàn)曾初步比較了三者對(duì)于山銀花中總皂苷顯色的穩(wěn)定性，對(duì)二甲氨基苯甲醛存在試劑空白顏色較深，可能干擾測(cè)定結(jié)果的情況；香草醛-高氯酸和茴香醛-濃硫酸體系顏色較淺，但顯色后穩(wěn)定性均不持久；參考文獻(xiàn)中香草醛-高氯酸為最常用的顯色體系，因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇了香草醛-高氯酸作為顯色劑，并采用正交試驗(yàn)對(duì)加熱溫度，高氯酸用量，加熱時(shí)間和香草醛-冰醋酸濃度等顯色條件進(jìn)行了優(yōu)選，最后選擇加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸，0.8 mL高氯酸于65 ℃反應(yīng)20 min作為顯色條件；根據(jù)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，限定樣品在顯色后4 h內(nèi)測(cè)定完畢。

REFERENCES

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Determination of Total Tritorpenoid Saponin in Different Buds Stages of Lonicerae Flos

GAO Lixin
(Puyang City Oil Field General Hospital, Puyang 457001, China)

OBJECTIVE To establish the determination method of total triterpenoid saponins in Lonicerae Flos. METHODS The colorimetric method was used with vanillin-perchloric acid as the chromogenic reagent. The detection wavelength was set at 477 nm. RESULTS The linear range of macranthoidin B was 0.501-6.012 μg·mL-1and the average recovery was 100.1%. The contents of total triterpenoid saponin in the samples collected from the different stages of the buds of L. macranthoides were various and fluctuated from 8.00%-21.41%. CONCLUSION The obvious difference of the total content of triterpenoid saponin is observed in six development stages of the whole flower season of L. macranthoides. The content of total teripenoid saponin in the silver phase is highest and the bud phase is lowest. The present investigation provides the scientific evidences for the optimal selection of collection and process of Lonicerae Flos.

Lonicerae Flos; total triterpenoid saponin; macranthoidin B; colorimetric method

R284.2

B

1007-7693(2013)10-1110-04

2012-11-05

高立新，男，副主任藥師 Tel: 13903931878 E-mail: zgyyglx@163.com