亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        益智多糖含量測定

        2013-03-06 08:29:04趙祥升董娜馮錦東楊美華
        中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學 2013年10期

        趙祥升,董娜,馮錦東,楊美華,3

        (1.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所,海南 萬寧 571533;2.河南科技學院生命科技學院,河南 新鄉(xiāng) 453003;3.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所,北京 100193)

        益智多糖含量測定

        趙祥升1,董娜2,馮錦東1,楊美華1,3

        (1.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所,海南 萬寧 571533;2.河南科技學院生命科技學院,河南 新鄉(xiāng) 453003;3.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所,北京 100193)

        目的 研究益智中多糖含量的測定方法。方法 水提醇沉法提取粗多糖,Sevage法除蛋白,H2O2脫色,流水透析和冷凍干燥制備多糖。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生,HPLC測定其單糖組成。以益智精制多糖測得多糖對葡萄糖的換算因子,苯酚-硫酸法測定益智中多糖的含量。結(jié)果 益智多糖由葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖5種單糖組成。益智多糖含量為12.91%,RSD=4.72%(n=5),平均加樣回收率為99.1%,RSD為4.57%(n=5)。結(jié)論 該法簡便,快捷,可用于益智多糖的含量測定。

        益智;多糖;單糖;含量測定

        多糖(polysaccharide)是由醛糖和酮糖通過糖苷鍵連在一起的聚合物,廣泛分布于自然界中,是一類重要的活性物質(zhì)。近年來,由于植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血糖等生物活性,不良反應(yīng)小等優(yōu)點[1-3],多糖的研究呈現(xiàn)增多的趨勢。植物中多糖含量測定常用的方法有:比色法如咔唑-硫酸法[4]、苯酚-硫酸法[5]、蒽酮-硫酸法[6]、3,5-二硝基水楊酸比色法[7]、斐林滴定法[8];高效液相色譜法(HPLC)[9];氣相色譜法(GC)[10];薄層掃描法(TLCS)[11]法;高效毛細管電泳法(HPCE)[12]等。HPLC和HPCE需要特殊的儀器設(shè)備,GC需要衍生化。因此最簡便、常用的是苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法,其原理是多糖在硫酸作用下水解成單糖分子,并迅速脫水生成糖醛衍生物,再與苯酚或蒽酮縮合成有色化合物,在適當?shù)牟ㄩL下和一定濃度范圍內(nèi),吸收值和糖濃度呈線性關(guān)系,從而可間接測定多糖含量。

        益智(Alpinia oxyphylla Miq.)為我國傳統(tǒng)的藥食兩用資源,其味辛,性溫,具有暖腎、固精、縮尿、溫脾止瀉攝唾的功效[13]。益智中主要含有揮發(fā)油、黃酮和糖類等活性成分,但有關(guān)其多糖的研究報道相對較少。汪金玉等[14]以果糖為對照品,紫外分光光度法測定了海南6個地區(qū)益智種子和果殼中低聚糖的含量,益智殼中的低聚糖含量(1.28%~2.48%)高于果仁(0.50%~1.14%)。吳德玲等[15-16]用苯酚-硫酸顯色法,比較了海南、廣東、廣西等不同來源益智藥材果實及種子、果殼中多糖的含量,結(jié)果表明不同來源的益智中果實中多糖含量差異不大(8.03%~8.62%);益智種仁中多糖含量(8.25%)高于果殼(4.66%)。植物中多糖的測定是以某一種單糖(如:葡萄糖、半乳糖等)為對照品,苯酚(或蒽酮)-硫酸比色法測定[17],該方法對于勻多糖比較合適。但植物多糖大多都是雜多糖,如果用某一種單糖作標曲,則會造成較大的誤差,益智多糖含量測定也存在這些問題。有關(guān)益智多糖的單糖組成、多糖對單糖之間換算因子的研究作者還未見報道。本實驗通過提純、精制多糖,確定了益智多糖的單糖組成,以精制的多糖測得益智多糖對葡萄糖的換算因子,用于校正益智中多糖含量的測定,為益智質(zhì)量控制和綜合利用提供了科學依據(jù)。

        1 材料與儀器

        1.1 材料與試劑

        益智來自海南省五指山市,樣品由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所馮錦東研究員鑒定為益智(Alpinia oxyphylla Miq.)果實;單糖:D-葡萄糖(Glu,批號:20110721),L-鼠李糖(Rha,批號:20101215),D-半乳糖(Gal,批號:20110627),D-甘露糖(Man,批號:20100506),L-阿拉伯糖(Ara,批號:20120613),D-木糖(Xyl,批號:20090814)均購自Solarbio公司,純度均>99.0%;乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純,水為Milli-Q超純水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Waters 1525高效液相色譜儀(美國Waters公司,帶紫外檢測器);UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津);KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6(國華電器有限公司);臺式高速離心機141(Thermo electron corporation);XS105DU十萬分之一電子天平(上海托利多有限公司);AL104-1C萬分之一電子天平(上海托利多有限公司);Milli-Q Academic A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);FD-2A真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 益智精制多糖的制備

        稱取已干燥的益智粉末100 g,加入石油醚(60~90 )500℃ mL,加熱回流1 h,提取2次,4 000 r·min-1離心10 min,棄去上清液,揮干石油醚,加入80%乙醇500 mL,回流提取2次,每次2 h,過濾,藥渣揮盡乙醇后,沸水提取2次(料水比為1∶20),每次提取2 h,離心(5 000 r·min-1,10 min),合并上清液,濃縮至100 mL,加入無水乙醇使醇含量達到80%,4 ℃冰箱過夜,過濾,真空冷凍干燥,得粗多糖。

        粗多糖以純水復(fù)溶,與等體積Sevage試劑[三氯甲烷-正丁醇(4∶1)]混合,振蕩,離心,收集上清液,上清液重復(fù)上述過程數(shù)次,用考馬斯亮藍法確認無蛋白。濃縮液加入體積分數(shù)為30%的H2O2原液適量,用0.5 mol·L-1的NaOH調(diào)節(jié)pH至8~9,45 ℃水浴4 h,將多糖脫色液至于透析袋中。先用流水透析1 d,再用純水透析2 d,透析后過濾濃縮,加乙醇使醇含量至80%,4 ℃冰箱過夜,過濾,濾渣依次用無水乙醇,丙酮,乙醚洗滌3次,真空冷凍干燥,得精制多糖。

        益智精致多糖的13C-NMR圖譜(溶劑為D2O)見圖1。化學位移98~110的信號為糖的端基碳信號,65~85的為糖氧環(huán)的C2~C4信號,60左右為C5或C6信號,18~20的為甲基五碳糖的C6信號,除上述糖信號外,未見其他信號,由此可判斷精致的益智多糖中基本不含其他雜質(zhì)[18-19]。

        圖1 益智精致多糖13C-NMR圖Fig 113C-NMR spectrum of refined polysaccharides in Alpinia oxyphylla Miq

        2.2 單糖組成分析

        2.2.1 對照品溶液的制備 取各單糖對照品用超純水配成2 mmol·L-1的混合水溶液,同時每單糖也配制為相同濃度的對照品溶液。

        2.2.2 PMP衍生化法測定精制多糖的單糖組成 按文獻方法[20],稱取10 mg益智精制多糖置于具塞試管中,加2 mol·L-1H2SO4溶液2.0 mL,封管后于110 ℃水解6 h,得水解樣品溶液。用4 mol·L-1NaOH水溶液中和至pH值為7.0,并以純化水稀釋到5.0 mL,離心,取上清液待衍生化。將單糖對照品、混合單糖對照品溶液及益智多糖水解樣品液各取200 μL分置于1.5 mL離心管中,然后向離心管中依次加入0.5 mol·L-11-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液100 μL和0.3 mol·L-1氫氧化鈉溶液100 μL,混勻后置于70 ℃水浴中加熱反應(yīng)30 min,取出室溫放置10 min;再加入0.3 mol·L-1鹽酸溶液100 μL中和,混勻后用等體積乙酸異戊脂萃取,振搖,離心10 min,小心棄去有機層,再用乙酸異戊脂萃取1次,再加等體積的氯仿,振搖,離心10 min,棄去氯仿相得到上層。將水相定容至1.0 mL,過0.45 μm微孔慮膜后,供HPLC進樣分析。

        2.2.3 色譜條件 色譜柱為Waters Sunfire C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1 mol·L-1KH2PO4(用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8)(16∶84),等度洗脫;流速:0.8 mL·min-1;柱溫:35 ℃,檢測波長:250 nm,進樣量:20 μL。

        圖2 單糖混合對照品衍生化(A)和益智多糖(B)的色譜圖1-PMP;2-D-甘露糖;3-L-鼠李糖;4-D-葡萄糖;5-D-木糖;6-D-半乳糖;7-L-阿拉伯糖Fig 2 HPLC chromatograms of PMP derivatization of monosaccharides reference substances(A) and polysaccharide(B) 1-PMP; 2-Man; 3-Rha; 4-Glu; 5-Xyl; 6-Gal; 7-Ara

        2.2.4 單糖組成分析 益智精制多糖經(jīng)降解、PMP衍生化后,進液相色譜分析,在混合標準單糖同樣的反應(yīng)和測定條件下,根據(jù)標準單糖的保留時間確定益智多糖由Glu,Rha,Gal,Man,Ara 5種單糖組成。

        2.3 益智多糖含量測定

        2.3.1 樣品溶液的制備 稱取益智粉0.5 g(n=5),加入25 mL石油醚加熱回流提取2次,每次1 h,揮干溶劑;濾渣用80%乙醇25 mL加熱回流提取2次,每次2 h,揮干乙醇;加25 mL蒸餾水,沸水浴中回流2 h,重復(fù)3次,抽濾,合并濾液,定容到100 mL量瓶;吸取該溶液1.0 mL,加無水乙醇4.0 mL,4 ℃冰箱放置過夜,析出沉淀,6 000 r·min-1離心10 min,吸出上清液,多糖沉淀以少量的80%乙醇洗滌,揮干乙醇;將多糖沉淀用蒸餾水溶解,定容到500 mL量瓶中,得樣品溶液。

        2.3.2 對照品溶液的制備 取葡萄糖適量,105 ℃下烘至恒重,精密稱取10.25 mg,純水定容到100 mL量瓶中,為對照品儲備液。

        2.3.3 最大吸收波長的確定 分別取樣品溶液、對照品溶液和純水各1 mL置于具塞試管中,分別加入1 mL 5%重蒸苯酚和5 mL的濃硫酸混勻,靜止20 min后放入沸水浴中反應(yīng)10 min,迅速取出置冰浴中冷卻至室溫,在400~600 nm內(nèi)掃描確定最大吸收波長,對照品和樣品溶液在484 nm處有最大的吸收峰。

        2.3.4 標準曲線的繪制 精密吸取對照品儲備液1.0,2.0,4.0,8.0,16.0,32.0 mL定容至50 mL的量瓶中,配成系列標準溶液。精密吸取系列標準溶液1 mL,以下操作同“2.3.3”,在484 nm處測定吸光度,繪制標準曲線,得回歸方程為:Y=103.46X+0.243 8(Y為每管中葡萄糖的含量,X為吸光度),r=0.999 9,葡萄糖濃度在2.05~65.60 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

        2.3.5 換算因子的測定 精密稱取益智精制多糖10.0 mg以水定容于250 mL的量瓶中,混勻,量取1 mL于具塞試管中,照“2.3.3”項下方法測定吸光度,計算多糖溶液中葡萄糖的濃度,按f=W/C·D計算換算因子,其中W為多糖質(zhì)量(mg),C為多糖中葡萄糖濃度,D為稀釋倍數(shù)。測得換算因子f=2.58(n=3),RSD=1.17%。

        2.3.6 儀器精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗 取同一濃度的葡萄糖溶液在上述反應(yīng)條件下顯色,測定吸光度(n=5),記錄吸光度,考察儀器精密度;另取樣品5份,精密稱重,分別按“2.3.1”項下的方法制備溶液,顯色測定吸光度,考察重復(fù)性;取“2.3.1”項下的樣品溶液,顯色,分別在0,2,4,8 h檢測吸光度(n=3),計算吸光度的RSD(%),考察其溶液穩(wěn)定性;結(jié)果吸光度的RSD均<5%,表明儀器精密度、方法重復(fù)性較好,樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.3.7 加樣回收實驗 精密稱取5份益智粉末0.25 g,加入精制多糖35 mg,按照“2.3.1”項下制備溶液,按“2.3.3”項下顯色并在484 nm下測定吸收值,計算回收率為99.1%,RSD為4.57%。

        2.3.8 益智多糖含量測定 精密吸取樣品溶液(n=5)1 mL于具塞試管中,按照苯酚-硫酸法測定吸光度,外標法計算樣品液中葡萄糖的濃度,按照下面公式計算益智中多糖的含量。樣品中含量(%)=(CDf/WR)×100%。式中:C為樣品液中葡萄糖的濃度,D為稀釋倍數(shù),f為換算因子,W為樣品質(zhì)量,R為回收率,結(jié)果益智多糖含量為12.91%,RSD=4.72%。

        3 討論

        本研究將益智多糖精制、純化,確定了多糖對葡萄糖的換算因子,為以后益智多糖含量測定提供了科學依據(jù)。有文獻[14-16]研究益智仁中多糖含量低于本實驗結(jié)果,可能與沒有利用換算因子消除單純以葡萄糖為標準計算多糖帶來的誤差和取材的部位有關(guān)。本研究在制備精制多糖除蛋白時,利用Sevage法并結(jié)合考馬斯亮藍法確認,醇沉、流水透析等方法并結(jié)合測定益智精制多糖13C-NMR譜,確認了其基本不含其他雜質(zhì)。該方法為益智多糖含量測定、質(zhì)量控制等研究提供了基礎(chǔ)。

        REFERENCES

        [1] SCHEPETKIN I A, QUINN M T. Botanical polysaccharides: Macrophage immunomodulation and therapeutic potential [J]. Int Immunopharmacol, 2006, 6(3): 317-333.

        [2] TAO Y W, TIAN G Y. Studies on the physicochemical properties, structure and antitumor activity of polysaccharide YhPS-1 from the root of Cordalis yanhusuo Wang [J]. Chin J Chem, 2006, 24(2): 235-239.

        [3] GE Y, DUAN Y F, FANG G Z, et al. Study on biological activities of Physalis alkekengi var. francheti polysaccharide [J]. J Sci Food Agric, 2009, 89 (9): 1593-1598.

        [4] HUANG R S. Advances in studies on analytical methods of polysaccharides in medical plants [J]. China Pharm(中國藥師), 2005, 8(1): 68-70.

        [5] ZHAO X S, ZHAO Y K, SHI F H, et al. Effects of different processing methods on the content of polysaccharide in the root of Platycodon grandiflorum [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學), 2010, 27(11): 983-986.

        [6] ZHANG Z F, JIN J, SHI L G. The analysis method of polysaccharides in Ramulus mori [J]. China J Mater Med(中國中藥雜志), 2008, 33(4): 462-464.

        [7] YANG H, ZHANG Y W, ZHANG L. Determination of polysaccharides in epimedium with DNS Method [J]. Tianjin Chem Ind(天津化工), 2012, 26(1): 60-62.

        [8] YU C, DING G Q, YU S, et al. The method research of lentinan determination [J]. China Public Health(中國公共衛(wèi)生), 2000, 16 (3): 245-246.

        [9] CASTERLINE J L, OLES C J,YUOH K U. Measurement of sugars and starches in foods by a modification of the AOAC total dietary fiber method [J]. J AOAC Int, 1999, 82(3): 759-765.

        [10] TU J H, CHEN W G, WANG L, et al. Monosaccharide composition analysis and compare the content of polysaccharides in different harvest yime from Trichosanthis Radix [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學), 2011, 28(7): 666-668.

        [11] DENG G D, YU J P, ZHENG B S. Determination of monosaccharides hydrolyzed from tea polysaccharides by dual-wavelength thin-layer scanning technique [J]. J Southwest Agricul Univ: Nat Sci(西南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版), 2004, 26(6): 703-705.

        [12] MA Q, HE Y Z, XIAO X Z, et al. Separation of saccharides in tobacco by capillary zone electrophoresis [J]. Chin J Chromatogr(色譜), 2002, 20(3): 230-232.

        [13] Ch.P(2010)VolⅠ(中國藥典2010版.一部) [S]. 2010: 273-274.

        [14] WANG J Y, CHEN K, LIN L, et al. Determination of oligosaccharides in the different parts of Alpinia oxyphylla [J]. Res Pract Chin Med(現(xiàn)代中藥研究與實踐), 2009, 23 (1): 40-42.

        [15] WU D L, JIN C S, MA K,et al. Quantitative determination of the polysaccharide content in Fructus Alpinia Oxyphylla [J]. Anhui Med Pharm J(安徽醫(yī)藥), 2007, 11(3): 218-219.

        [16] WU D L, JIN C S, KOU W Q, et al. Comparative study of components in different parts of Alpinia oxyphylla [J]. Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑雜志), 2007, 13(4): 1-3.

        [17] YANG Y Q, JIANG Q H, DING P T. Advances in studies on analytical methods of polysaccharides in plant [J]. Chin Tradit Herb Drugs(中草藥), 2011, 42 (6): 1239-1242.

        [18] SUN L, QIAO S Y, ZHAO Y M. Studies on content determination of polysaccharides in Periploca forrestii [J]. China J Mater Med(中國中藥雜志), 2009, 34(10): 1241-1244.

        [19] LV Y L, WANG D, LI X R, et al. Determination of polysaccharides content in Aconitum carmichaeli [J]. Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志), 2011, 31(5): 835-838.

        [20] DAI J, ZHU S, TANG J. Analysis of monosaccharide compositions in polysaccharides from D. salina by pre-column derivatization high performance liquid chromatography [J]. J Instrum Anal(分析測試學報), 2007, 26(2): 206-210.

        Determination of Polysaccharides Content in Alpinia Oxyphylla

        ZHAO Xiangsheng1, DONG Na2, FENG Jindong1, YANG Meihua1,3
        (1.Hainan Branch Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medicinal Sciences, Wanning 571533, China; 2.Life Science and Technology Department, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China; 3.Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193, China)

        OBJECTIVE To establish a method for content determination of polysaccharides in Alpinia oxyphylla. METHODS The crude polysaccharides were extracted by hot water and precipitated with ethanol. The purified polysaccharide was obtained by removing protein and colors with Sevage and H2O2, repectively, then run water dialysis and frozen-drying. The monosaccharide composition was determined by HPLC after precolum-derivatization with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP). The conversion coefficient of Alpinia oxyphylla polysaccharides to glucose was obtained by refined polysaccharides, and then the content of crude polysaccharides in Alpinia oxyphylla was determined by sulfuric acid-phenol method. RESULTS The monosaccharide compositions in polysaccharides from Alpinia oxyphylla were Glu, Rha, Gal, Man, and Ara. The content of polysaccharides was 12.91%(RSD=4.72%, n=5), and the average recovery was 99.1% with RSD of 4.57%(n=5). CONCLUSION The method is sample, and can be used for determination of the content of polysaccharides from Alpinia oxyphylla.

        Alpinia oxyphylla; polysaccharide; monosaccharide; content determination

        R917.101

        B

        1007-7693(2013)10-1070-05

        2012-12-27

        中央公益性基金項目(2011HNB04);海南省中藥現(xiàn)代化專項項目(2010ZY011)

        趙祥升,男,助理研究員 Tel: (0898)62553667 E-mail: xiangsheng437@163.com

        国产成人拍精品免费视频| 一区二区在线视频免费蜜桃| 国产高清在线精品一区二区三区 | 中文字幕一区二区三区在线不卡| 日韩在线视频不卡一区二区三区| 综合成人亚洲网友偷自拍| 亚洲 日本 欧美 中文幕| 狠狠躁夜夜躁人人爽天天古典| 香蕉人妻av久久久久天天| 国产AV无码专区亚洲AV桃花庵 | 久久免费看黄a级毛片| 五十路丰满中年熟女中出| 亚洲av有码在线天堂| 黄色大片一区二区中文字幕| 亚洲国产精品激情综合色婷婷| 精品+无码+在线观看| 国产老熟女狂叫对白| 久久精品国产亚洲vr| 国产呦系列视频网站在线观看| 亚洲在中文字幕乱码熟女| 91精品啪在线观九色| 久久精品国产免费观看| 五月天激情综合网| 中文亚洲AV片在线观看无码| 青青青爽在线视频免费播放| 国产精品亚洲а∨无码播放| 久久九九久精品国产| 国产精品九九九无码喷水| 国产在线精彩自拍视频| 亚洲一区二区国产一区| 精品无码国产一区二区三区av| 国产在线无码一区二区三区| 调教在线播放黄| 日韩人妻一区二区中文字幕| 欧美老肥妇做爰bbww| 中文成人无字幕乱码精品区| 亚洲黄色在线看| 少妇厨房愉情理伦bd在线观看| 欧美一性一乱一交一视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲一区二区三区在线更新|