張得鈞,杜恒,劉明成,李福安,蘆殿香,馬建濱
(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,西寧 810001;2.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程
學(xué)院,西寧 810016;3.青海師范大學(xué)生命與地理學(xué)院,西寧 810008)
藏藥莪達(dá)夏對(duì)大鼠心肌缺血再灌注NO和NOS的影響
張得鈞1,2,杜恒1,劉明成2,李福安1,蘆殿香1,馬建濱3
(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院,西寧 810001;2.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程
學(xué)院,西寧 810016;3.青海師范大學(xué)生命與地理學(xué)院,西寧 810008)
目的 研究藏藥莪達(dá)夏水提物對(duì)大鼠心肌缺血再灌注后,心肌組織中NO含量、一氧化氮合酶(NOS)、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)活性的影響,從而探討其對(duì)心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。方法 采用結(jié)扎大鼠冠脈左前降支的方法造成心肌缺血再灌注模型,測(cè)定再灌注40 min后心肌組織中NO含量以及NOS、iNOS的活性。結(jié)果 心肌缺血再灌注模型組心肌組織中NOS、iNOS活性和NO含量水平明顯高于正常對(duì)照組。莪達(dá)夏水提物高、中、低劑量組心肌組織中NOS、iNOS活性水平以及NO含量水平均低于模型組。結(jié)論 藏藥莪達(dá)夏能夠通過降低NOS、iNOS活性和NO含量水平,從而對(duì)大鼠缺血再灌注心肌損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。
莪達(dá)夏;心肌缺血再灌注;一氧化氮;一氧化氮合酶
莪達(dá)夏(Oxytropis falcate Bunge)為豆科棘豆屬鐮形棘豆植物,據(jù)《晶珠本草》記載,莪達(dá)夏具有生肌愈瘡、利便、防止骨刺產(chǎn)生、治病痛、清熱除毒、澀脈止血之功效,并能清毒、治療炭疽病、麻風(fēng)病及流感、扁桃體炎,被譽(yù)為“草藥之王”[1]。有關(guān)莪達(dá)夏的研究被許多學(xué)者所關(guān)注[2-4],現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,其對(duì)心血管系統(tǒng)具有良好的保護(hù)作用,其所含總黃酮苷元能增加離體心臟冠脈的灌流量,對(duì)心縮力產(chǎn)生抑制作用。其所含的喹喏里西定類生物堿,具有抗心律失調(diào)的生理活性[5]。一氧化氮(NO)是重要的生物作用調(diào)節(jié)分子,作用非常廣泛,其合成受一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)表達(dá)及其活性的調(diào)節(jié)。一些研究發(fā)現(xiàn),NO釋放減少與許多心血管病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6-8],如心絞痛、心肌梗死、高血壓等。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制大鼠心肌缺血再灌注損傷模型,觀察大鼠心肌組織中NO的含量以及NOS、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性的變化,探討藏藥莪達(dá)夏抗心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機(jī)制。
1.1 動(dòng)物
2月齡SD大鼠60只,♀♂各半,體質(zhì)量(150± 20)g,購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證編號(hào):SCXK(甘)2012-0004。
1.2 儀器
DW.2000型小動(dòng)物人工呼吸機(jī)(上海嘉鵬科技有限公司);RM-6280型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(上海軟隆科技發(fā)展有限公司);Beckmancoulter UniCel DxC 800 Synchron全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司);JY5002 型電子天平(上海升隆電子科技有限公司);JEOL-1230透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。
1.3 藥物及試劑
莪達(dá)夏原藥材采自青海省青海湖畔沙丘地帶,經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院魏全嘉教授鑒定為藏藥莪達(dá)夏。莪達(dá)夏全草水提取部分制備:將采得的藥材分揀干凈、粉碎,并按1∶10的比例加純化水,靜置12 h后,于電磁爐中90 ℃煎煮直至成膏狀,置60 ℃恒溫箱中烘干,得成藥,用打粉機(jī)粉碎至顆粒狀,獲得藥粉水提物粗品備用。普萘洛爾(山西晉太藥業(yè),規(guī)格:10 mg·片-1,批號(hào):20110502);NO測(cè)試試劑盒(批號(hào):2012022008)、NOS測(cè)試試劑盒(批號(hào):20120220012)、NOS分型測(cè)試試劑盒(批號(hào):20120220013)均購自北京瑞格博科技發(fā)展有限公司;氨基甲酸乙酯(烏拉坦,上海吉化有限公司,批號(hào):110919)。
2.1 動(dòng)物分組與給藥
將大鼠按每組10只,♀♂各半,隨機(jī)分為6組:①假手術(shù)組;②模型組;③莪達(dá)夏水提物高劑量組;④莪達(dá)夏水提物中劑量組;⑤莪達(dá)夏水提物低劑量組;⑥對(duì)照組。莪達(dá)夏給藥劑量按照文獻(xiàn)[9]和預(yù)實(shí)驗(yàn)中莪達(dá)夏急性毒理學(xué)最大致死量的結(jié)果設(shè)定,高劑量組按照最大致死量的十分之一確定,給藥高、中、低劑量分別為15,10,5 g·kg-1·d-1。假手術(shù)組和模型組給等量純凈水,對(duì)照組以普萘洛爾0.6 g·kg-1·d-1給藥,各組連續(xù)灌胃給藥10 d。
2.2 動(dòng)物模型建立
將大鼠末次灌胃給藥禁食24 h后,25%烏拉坦腹腔注射麻醉(5 mL·kg-1)。仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上,將針狀電極插入四肢皮下,連接RM-6280型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng),穩(wěn)定5 min后記錄正常Ⅱ?qū)?lián)心電圖;切開氣管,連接動(dòng)物呼吸機(jī),沿胸骨左緣剪開3、4、5肋骨,暴露心臟,剪開心包膜。以左冠狀動(dòng)脈為標(biāo)志,用3/8圓3X10不銹鋼圓針,在左冠狀動(dòng)脈下穿一3-0絲線。進(jìn)針深度為穿過心肌1 mm左右,進(jìn)出針間寬度在動(dòng)脈周圍1.5~2 mm左右,穩(wěn)定15 min左右,待各指標(biāo)穩(wěn)定,將一細(xì)小乳膠管墊于血管與結(jié)扎線之間,拉緊結(jié)扎線使細(xì)小乳膠管壓迫左冠狀動(dòng)脈而致閉塞。結(jié)扎30 min后,松開結(jié)扎線再灌注40 min,依心電圖上ST段抬高≥0.3 mV和(或)T波高聳及局部心肌出現(xiàn)發(fā)紺作為心肌缺血標(biāo)志,心電圖ST段降低和(或)T波恢復(fù)及心肌缺血區(qū)轉(zhuǎn)紅為再灌注成功標(biāo)志[10]。
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
2.4 心電圖的觀察指標(biāo)
本實(shí)驗(yàn)對(duì)心肌缺血程度的觀察指標(biāo)主要定為J點(diǎn)位移。J點(diǎn)位移測(cè)量以P-R段為基線,每時(shí)間點(diǎn)測(cè)5個(gè)連續(xù)波形,取其平均值。記錄并計(jì)算J點(diǎn)位移的變化值,無論升高或降低,取變化的絕對(duì)值,結(jié)果見表1。莪達(dá)夏高、中、低劑量可使結(jié)扎冠狀動(dòng)脈所致缺血再灌注損傷大鼠的導(dǎo)聯(lián)心電圖ST段的升高明顯降低,與模型組相比有顯著性差異。
表1 各組心電圖ST段變化的比較(n=10,±s )Tab 1 The comparison of the ST waves among groups(n=10,±s )
表1 各組心電圖ST段變化的比較(n=10,±s )Tab 1 The comparison of the ST waves among groups(n=10,±s )
注:與模型組比較,1)P<0.05,2)P<0.01Note: Compare with the model group,1)P<0.05,2)P<0.01
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2.5 NOS、iNOS活性以及NO含量測(cè)定
操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行,結(jié)果見表2。與正常對(duì)照組比較,缺血再灌注模型組大鼠心肌組織中,總NOS 和iNOS活性明顯增強(qiáng),伴有心肌NO水平顯著增高。高、中、低3個(gè)劑量組中,隨著給藥劑量的逐漸增高,總NOS和iNOS活性明顯減弱,NO水平顯著降低。
表2 各組大鼠心肌缺血再灌注后心肌組織NO、NOS、iNOS含量的變化(n=10,x±s )Tab 2 The concentration changes of NO, NOS, iNOS among groups after myocardial ischemia-reperfusion injury (n=10,x±s )
2.6 組織形態(tài)學(xué)觀察
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后留取左心室肌,快速放入4%戊二醛固定液固定處理。制片時(shí)取各組樣品3個(gè),分別固定于1/15 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS)配制的3%戊二醛固定液2 h;PBS液漂洗3次,每次10 min;1%鋨酸固定1.5 h,PBS液漂洗3次,每次10 min;50%,70%,80%,90%,100%梯度脫水,每次10 min;純丙酮脫水2次,每次10 min;EPON-812環(huán)氧樹脂-純丙酮(1∶1)浸透2 h;EPON-812環(huán)氧樹脂包埋,35 ℃,24 h;45 ℃,24 h;65 ℃,24 h聚合;半薄切片,甲苯胺藍(lán)染色,光鏡下定位,超薄切片,透射電子顯微鏡觀察,記錄。每組均取放大倍數(shù)為10 000倍,隨機(jī)用CCD相機(jī)采集7~10張做為定量之用,并對(duì)每組較典型的正?;虍惓P募〕⒔Y(jié)構(gòu)進(jìn)行底片照相,并做定性觀察,結(jié)果見圖1。與正常對(duì)照組比較,缺血再灌注模型組組織形態(tài)學(xué)觀察可見肌原纖維內(nèi)大量收縮帶,肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,肌纖維內(nèi)脂滴增多,心肌細(xì)胞連接處電子密度降低,肌絲排列稀疏,潤盤解離,局部肌纖維內(nèi)線粒體腫脹嵴疏松,部分嵴消失,心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重。
圖1 各組大鼠心肌缺血再灌注后超顯微結(jié)構(gòu)變化(10 000×) A-模型組;B-假手術(shù)組;C-低劑量組;D-中劑量組;E-高劑量組;F-對(duì)照組Fig 1 The comparison of the myocardial ischemia-reperfusion injury ultrastructure among groups(10 000×) A-ischemia and reperfusion model group; B-sham operation; C-low dose; D-middle dose; E-high dose; F-control group
急性心肌缺血是造成心臟性猝死的主要原因,而一定時(shí)間缺血后再灌注不但加重心肌損傷,還可造成致命性心律失常。缺血再灌損傷的機(jī)制也較為復(fù)雜,參與因素眾多。NO是生物體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子,具有神經(jīng)介質(zhì)和調(diào)質(zhì)的功能,廣泛參與體內(nèi)生理和病理活動(dòng)。其在心肌缺血再灌注損傷中的作用受到高度重視,但是NO在心肌缺血再灌注中是起保護(hù)因子作用抑或是起細(xì)胞毒性作用目前尚有爭議,NO可能發(fā)揮損傷或保護(hù)的雙重作用[11],一些研究發(fā)現(xiàn),NO釋放減少與許多心血管病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),如心絞痛、心肌梗死、高血壓等。另一些研究則表明NO生成過多對(duì)心血管系統(tǒng)也有顯著的不良作用,對(duì)心肌細(xì)胞具有損傷作用[12-13]。NOS是NO合成的關(guān)鍵酶,可分為3種類型:神經(jīng)元型(nNOS),內(nèi)皮結(jié)構(gòu)型(eNOS),誘導(dǎo)型(iNOS)。nNOS與eNOS的激活均依賴于鈣離子和鈣調(diào)蛋白的作用。iNOS可由炎癥因子、內(nèi)毒素等誘導(dǎo)激活,作用時(shí)間長,可催化生成大量NO。心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞都能夠表達(dá)iNOS,在心力衰竭、擴(kuò)張性心臟病、缺血性心臟病時(shí)iNOS表達(dá)增加,體內(nèi)的一些活性物質(zhì)如兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ都能夠促進(jìn)和維持iNOS的表達(dá)[14-16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,缺血再灌注模型組大鼠心肌組織中,總NOS和iNOS活性明顯增強(qiáng),伴有心肌NO水平顯著增高,組織形態(tài)學(xué)觀察可見肌原纖維內(nèi)大量收縮帶,肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,肌纖維內(nèi)脂滴增多,心肌細(xì)胞連接處電子密度降低,肌絲排列稀疏,潤盤解離,局部肌纖維內(nèi)線粒體腫脹嵴疏松,部分嵴消失,心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了心肌缺血再灌注后總NOS尤其是iNOS活性增強(qiáng),從而釋放NO,過量的NO導(dǎo)致了心肌缺血損傷,支持了NO升高可能是加重心肌缺血再灌注損傷的因素。莪達(dá)夏水提物高、中劑量組和心得安組大鼠心肌中總NOS和iNOS活性明顯較低,高劑量組和心得安組NO水平顯著降低。高、中、低劑量組電鏡下心肌超微結(jié)構(gòu)觀察也進(jìn)一步證實(shí)心肌損傷隨劑量增高而減輕顯著,線粒體基本趨向正常,提示莪達(dá)夏可能通過抑制心肌NOS活性,減少產(chǎn)生過量NO,從而削弱了對(duì)心肌細(xì)胞損傷的作用,這與王超等的研究結(jié)果相一致:NO、NOS在心肌缺血再灌注過程中起著雙重作用,可能在不同的動(dòng)物、組織,在不同的缺血再灌注時(shí)其含量、活性及病理生理效應(yīng)是不同的,NO供體、NO前體藥物及NOS抑制劑如果合理使用均可起到心肌保護(hù)作用[17-18]。NO介導(dǎo)心肌損傷的機(jī)制可能主要與過氧化亞硝酸陰離子有關(guān),Wang等[19]在離體大鼠心肌缺氧再氧合模型中,對(duì)NO超氧陰離子及過氧化、亞硝酸陰離子的過程變化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)它們?cè)谠俟嘧⒃缙谕缴?,L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)可使NO水平明顯下降,同時(shí)過氧化亞硝酸陰離子的生成也明顯減少,左室功能改善,過氧化亞硝酸陰離子可能是引發(fā)再灌注損傷因素,L-NAME通過降低NO水平,減少過氧化亞硝酸陰離子的生成,而起到心肌保護(hù)作用[20]。研究結(jié)果顯示,心肌缺血再灌注后,心肌組織中NO和NOS含量明顯增加。
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Influence of Oxytropis Falcate Bunge on NO and NOS of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rats
ZHANG Dejun1,2, DU Hen1, LIU Mingcheng2, LI Fu’an1, LU Dianxiang1, MA Jianbin3
(1.Medical College of Qinghai University, Xining 810001, China; 2.College of Eco-Environmental Engineering, Qinghai University, Xining 810016, China; 3.Qinghai Normal University of Biology and Geogrpahy Science, Xining 810008, China)
OBJECTIVE To study the influence of Oxytropis falcate Bunge on the content of NO, and the activities of NOS and iNOS in myocardial ischemia and reperfushon injury rats to explore its possible protective mechanism in vivo. METHODS The model of myocardial ischemia reperfusion injury in rats was employed by ligating the artery of left anterior descending. After the following reperfusion for 40 minutes, the concentration of NO and the enzymatic activities of NOS, iNOS in rats’myocardial tissue were tested. RESULTS The results showed that the enzymatic activities of NOS, iNOS and the concentration of NO of myocardial tissue in ischemia-reperfusion model group were much higher than that of normal control group. The enzymatic activity of NOS, iNOS and the concentration of NO of myocardial tissue in test groups were lower than that of model group. CONCLUSION Oxytropis falcate Bunge plays protection effects during acute myocardial ischemia-reperfusion injury in rats in vivo by decreasing the enzymatic activity of NOS, iNOS and the concentration of NO.
Oxytropis falcate Bunge; myocardial ischemia-reperfusion injury; NO; NOS
R965.2
A
1007-7693(2013)10-1054-05
2013-01-05
青海省科技廳項(xiàng)目(2011-Z-704);教育部“春暉計(jì)劃”科研項(xiàng)目(Z2011021)
張得鈞,男,博士,教授 Tel: (0971)5312936 E-mail: djzhang@nwipb.ac.cn