方 騫，梁慶紅，郝明明，王 燁，張 琳

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院兒科，河北石家莊050051）

·論 著·

喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群變化與CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞關(guān)系的研究

方 騫，梁慶紅，郝明明，王 燁，張 琳*

（河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院兒科，河北石家莊050051）

目的探討腸道菌群變化、CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞在喘息樣支氣管炎患兒發(fā)病機(jī)制中的作用關(guān)系。方法采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（flurogenic quantitative polymerase chain reaction，F(xiàn)Q-PCR）、流式細(xì)胞技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分別檢測47例喘息樣支氣管炎患兒、40例急性支氣管炎患兒、43例同期健康查體兒童糞便中雙歧桿菌和大腸桿菌數(shù)量、外周血單個(gè)核細(xì)胞CD3+CD8-IL-17+濃度和血漿白細(xì)胞介素（interleukin-17，IL-17）水平。結(jié)果①喘息樣支氣管炎患兒和急性支氣管炎患兒糞便中雙歧桿菌數(shù)量、雙歧桿菌/大腸桿菌（bifidobacteria/E.coli，B/E）值低于健康對照組（P＜0.05）；喘息樣支氣管炎患兒雙歧桿菌數(shù)量、B/E值低于急性支氣管炎患兒（P＜0.05）。②喘息樣支氣管炎、急性支氣管炎患兒外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和血漿IL-17水平均高于健康對照組（P＜0.05）；喘息樣支氣管炎患兒外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于急性支氣管炎患兒（P＜0.05），血漿IL-17水平低于急性支氣管炎患兒（P＜0.05）。③喘息樣支氣管炎和急性支氣管炎患兒外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與血漿IL-17水平呈正相關(guān)。喘息樣支氣管炎患兒腸道B/E值與外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論喘息樣支氣管炎患兒發(fā)病初期即發(fā)生腸道菌群紊亂，腸道微生物定植抗力降低，CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與其病理機(jī)制。

支氣管炎；雙歧桿菌；大腸桿菌

近10年兒童哮喘發(fā)病率呈上升趨勢，流行病學(xué)資料顯示85％兒童哮喘在3歲前發(fā)病［1］，除了哮喘診斷率提高外，部分原因是對嬰幼兒期喘息樣支氣管炎的診治重視不夠，減少嬰幼兒期喘息反復(fù)發(fā)作，可降低兒童哮喘的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。哮喘的病因和病理機(jī)制復(fù)雜，Th1/Th2失衡是其經(jīng)典發(fā)病學(xué)說，近年來發(fā)現(xiàn)CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞不僅參與自身免疫性疾病、腫瘤、感染性疾病和急性冠狀動(dòng)脈綜合征等疾病的發(fā)病，且在哮喘等過敏性疾病中發(fā)揮重要作用。腸道正常菌群對機(jī)體免疫的成熟和發(fā)育起到重要作用，并誘導(dǎo)口服免疫耐受。濕疹、食物過敏、過敏性皮炎和哮喘患兒腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，補(bǔ)充益生菌在防治過敏性疾病中起到積極作用。本研究通過觀察喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群變化、外周血單個(gè)核細(xì)胞CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和血漿白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）水平，探討腸道菌群結(jié)構(gòu)與CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞在其發(fā)病中的作用關(guān)系，為其發(fā)病機(jī)制提出新觀點(diǎn)，并為益生菌早期應(yīng)用預(yù)防喘息樣支氣管炎反復(fù)發(fā)作提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2011年10月—2012年3月在我院兒科住院的喘息急性發(fā)作并符合喘息樣支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］的47例患兒為A組，其中男性22例，女性25例，年齡1.6～2.5歲，平均（2.10± 0.26）歲；選擇同期入院符合急性支氣管炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］的40例患兒為B組，其中男性17例，女性23例，年齡1.5～2.8歲，平均（2.20±0.28）歲；選擇同期在我院健康查體兒童43例為C組，其中男性21例，女性22例，年齡1.4～2.5歲，平均（2.1± 0.25）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)包括無心、肺、肝或腎疾患；近6個(gè)月無呼吸道和消化道感染史；無個(gè)人及家族過敏性疾患及其他變態(tài)反應(yīng)性疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)包括入院前2周應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、免疫調(diào)節(jié)劑；原發(fā)或繼發(fā)性免疫功能缺陷；活動(dòng)性肺結(jié)核；先天性氣道、肺實(shí)質(zhì)發(fā)育異常；先天性心臟病；胃食管反流；有心、肝、腎疾病者；近2個(gè)月內(nèi)發(fā)生腹瀉或服用益生菌制劑者；入院前1周使用抗生素者。3組均為石家莊周邊縣市兒童，喂養(yǎng)方式為斷乳后添加輔食，3組性別、年齡、體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法：3組均于入院當(dāng)日或次日清晨空腹下抽取外周靜脈血2mL于肝素鈉抗凝管中，1 500r/min離心10min，取上清液置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時(shí)收集兒童4h內(nèi)糞便置于無菌干燥瓶，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采?6SrRNA熒光定量PCR檢測各組患兒腸道雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量，應(yīng)用Corbett Research公司生產(chǎn)的Rotor-Gene熒光定量PCR儀；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血單個(gè)核細(xì)胞CD3+CD8-IL-17+水平，流式細(xì)胞儀Epics XL由美國Beckman coulter公司生產(chǎn)；采用ELISA法檢測血漿中IL-17的水平，人IL-17 ELISA定量檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，分別采用F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Perason直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腸道菌群：A、B組糞便中雙歧桿菌濃度、B/E值均低于C組（P＜0.05）；A組雙歧桿菌濃度、B/E值低于B組（P＜0.05）。見表1。

2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和血漿IL-17水平：A、B組外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和血漿IL-17水平高于C組（P＜0.05）；A組外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于B組，血漿IL-17水平低于B組（P＜0.05）。見表2。

2.3 相關(guān)性分析：A、B組外周血CD3+CD8-IL-17+百分?jǐn)?shù)與血漿IL-17均呈正相關(guān)（r=0.377、0.329，P＜0.05）；A組腸道B/E值與CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.349，P＜0.05）。

表1 3組腸道雙歧桿菌、大腸桿菌菌群數(shù)量比較Table 1 Comparision of quantity of fecal m icroorganism s am ong three groups（±s）

表1 3組腸道雙歧桿菌、大腸桿菌菌群數(shù)量比較Table 1 Comparision of quantity of fecal m icroorganism s am ong three groups（±s）

*P＜0.0 5 vs group C #P＜0.05 vs group B by q test

Groups n Bifidobacteria（copies/g）B/E A 47 5.22±0.55*#7.81±1.00 0.72±0.11*#E.coli（copies/g）B 40 5.99±0.64*7.87±0.86 0.81±0.24*C 43 8.94±0.85 7.60±1.01 1.17±0.21

表2 3組外周血單個(gè)核細(xì)胞CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和血漿IL-17濃度比較Table 3 Percentage of CD3+CD8-IL-17+（Th17）cells and concentrations of the p lasma IL-17 in three groups（±s）

表2 3組外周血單個(gè)核細(xì)胞CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和血漿IL-17濃度比較Table 3 Percentage of CD3+CD8-IL-17+（Th17）cells and concentrations of the p lasma IL-17 in three groups（±s）

*P＜0.05 vs group C #P＜0.05 vs group B by q test

Groups n CD3+CD8-IL-17+（％）IL-17（ng/L）A 47 0.36±0.10*170.16±37.32*#B 40 0.33±0.10*225.06±58.37*43 0.26±0.11 108.93±21.31 C

3 討 論

世界范圍內(nèi)哮喘和過敏性疾病發(fā)病率普遍增高［3］。不同國家過敏性疾病患病率不同，而且過敏性疾病兒童與健康兒童間腸道菌群的構(gòu)成也有所不同，主要表現(xiàn)在腸道原居菌和梭狀芽孢桿菌數(shù)量的變化。我們立足于微生態(tài)學(xué)觀點(diǎn)，探討喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群變化及與CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的作用關(guān)系，闡釋腸道菌群與CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞在兒童喘息發(fā)作中的作用機(jī)制。

人體腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，在抵御病原微生物的侵入（防御感染）、限制病原微生物生長、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和促進(jìn)營養(yǎng)吸收等方面發(fā)揮重要作用。流行病學(xué)資料顯示過敏兒童與健康兒童相比，腸道梭狀芽胞桿菌數(shù)量增多而雙歧桿菌數(shù)量減少［4］。本研究顯示，喘息樣支氣管炎和急性支氣管炎患兒腸道雙歧桿菌數(shù)量和B/E值均低于健康兒童，而且喘息樣支氣管炎患兒在喘息急性發(fā)作時(shí)腸道雙歧桿菌數(shù)量和B/E值低于急性支氣管炎患兒。表明喘息發(fā)作處應(yīng)激狀態(tài)時(shí)機(jī)體存在低氧血癥，腸道環(huán)境發(fā)生改變，加之受到病原微生物的侵襲，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，引發(fā)腸道菌群紊亂。

CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞是近來發(fā)現(xiàn)的不同于Th1、Th2的另一種CD4+T細(xì)胞的新亞型，是重要的促炎癥細(xì)胞，可通過分泌IL-17誘導(dǎo)多種前炎癥因子和趨化因子。IL-17是T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因素［5］，是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-8，誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)IL-8、粒細(xì)胞集落刺激因子、CXCLl等，并誘導(dǎo)支氣管成纖維細(xì)胞表達(dá)IL-8、IL-6和CXCL1/Gro-α等，而IL-8和CXCLl是中性粒細(xì)胞趨化因子，IL-6和粒細(xì)胞集落刺激因子是中性粒細(xì)胞生成因子，促進(jìn)粒細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)和加重氣道炎癥反應(yīng)。國內(nèi)一項(xiàng)研究［6］顯示，5歲以下喘息兒童有特應(yīng)質(zhì)高危因素組和無特應(yīng)質(zhì)高危因素組IL-17水平均較同期同齡對照組兒童增高。Xiong等［7］的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，哮喘大鼠肺組織中Th17細(xì)胞分泌的IL-17A與支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞增多明顯正相關(guān)，因此IL-17A可能與哮喘中嗜酸粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞增多有關(guān)。本研究顯示，喘息樣支氣管炎和急性支氣管炎患兒外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和血漿IL-17水平較健康兒童升高。說明CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞參與了氣道的炎癥，并激活T細(xì)胞的分化向CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞傾斜，引起IL-17分泌增多，兩者間存在直線正相關(guān)關(guān)系。

CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞是促進(jìn)炎癥反應(yīng)的輔助T細(xì)胞，許多細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞、信號分子、Toll樣受體等參與CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的分化。國外一項(xiàng)研究［8］發(fā)現(xiàn)，特定的腸道共生菌能夠促進(jìn)小腸黏膜固有層CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的分化，不依賴于Toll樣受體、IL-21或IL-23信號途徑，但需要轉(zhuǎn)化生長因子β的活化作用。大量細(xì)菌微生物維持機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)，調(diào)節(jié)對病原微生物的免疫應(yīng)答［3］。腸道菌群也可能通過作用于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞起到間接調(diào)控CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的作用。本研究顯示，喘息樣支氣管炎患兒腸道B/E值與外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)呈直線負(fù)相關(guān)。說明喘息樣支氣管炎患兒腸道菌群的變化與外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)存在關(guān)系，菌群的紊亂通過影響腸道黏膜免疫系統(tǒng)或機(jī)體免疫應(yīng)答影響CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞的分化發(fā)育，而且CD3+CD8-IL-17+參與了發(fā)病初期的炎癥反應(yīng)，并加劇了腸道微生態(tài)環(huán)境的改變。

哮喘是一個(gè)復(fù)雜的免疫性疾病，眾多的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)參與發(fā)病過程，CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)，彌補(bǔ)了Th1/Th2失衡機(jī)制的不足，但CD3+CD8-IL-17+和IL-17作用在哮喘發(fā)病的不同階段，尤其在免疫細(xì)胞、分子網(wǎng)絡(luò)中的相互調(diào)節(jié)作用及其與腸道菌群的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步揭示。喘息樣支氣管炎患兒腸道雙歧桿菌數(shù)量減少、腸道微生物定植抗力降低，腸道菌群的紊亂影響機(jī)體的免疫反應(yīng)，加劇炎癥反應(yīng)，所以在防治疾病的同時(shí)糾正腸道菌群失衡是必要的，這又為我們提出了一系列問題，攝入益生菌是否能預(yù)防哮喘和過敏性疾病，還需要大量的臨床和實(shí)驗(yàn)室研究，以提供證據(jù)。在喘息樣支氣管炎發(fā)病早期積極控制炎性反應(yīng)、改善喘息癥狀同時(shí)調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，不失為一種預(yù)防和治療哮喘和過敏性疾病的新途徑。

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（本文編輯：劉斯靜）

圖2 成人型多囊腎（LK：左腎）

圖3 孕婦雙腎（LK：左腎；RK：右腎）

圖4 胎兒單純性腎回聲增強(qiáng)（LK：左腎；RK：右腎）

討 論在常規(guī)產(chǎn)前超聲檢查中，遇到胎兒腎臟回聲增強(qiáng)應(yīng)該考慮以下疾?。孩賸雰盒投嗄夷I，為常染色體隱性遺傳。超聲表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟對稱性、均勻性增大；孕晚期胎兒雙側(cè)腎臟顯著增大，可達(dá)正常腎臟的3～10倍；雙側(cè)腎臟回聲增強(qiáng)，以腎髓質(zhì)為主；孕晚期羊水過少。例1即為典型病例。②成人型多囊腎，為常染色體顯性遺傳。超聲表現(xiàn)為雙側(cè)腎臟增大，回聲增強(qiáng)，但與嬰兒型多囊腎相反的是，成人型多囊腎可較好地顯示低回聲的腎髓質(zhì)，且腎髓質(zhì)無明顯增大；羊水量正常。父母一方有多囊腎超聲表現(xiàn)是診斷胎兒成人型多囊腎的有力證據(jù)。例2是典型病例。③染色體異常胎兒腎臟表現(xiàn)。④巨細(xì)胞病毒感染是腎臟回聲增強(qiáng)的另一個(gè)常見原因，但如果檢出腦積水、腦室周圍鈣化灶、小頭畸形時(shí)，則提示此種感染的可能性較大。⑤單純性胎兒腎臟回聲增強(qiáng)或腎臟發(fā)育不良。例3則是典型病例。

綜上所述，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胎兒腎臟回聲增強(qiáng)時(shí)應(yīng)該重點(diǎn)觀察腎臟的大小、回聲增強(qiáng)部位以及羊水量的多少，尤其是動(dòng)態(tài)觀察，以期為臨床處理提供必要的依據(jù)。另外，對單純性胎兒腎臟回聲增強(qiáng)也不能掉以輕心，在產(chǎn)后應(yīng)加強(qiáng)隨訪，其中有些可能存在腎臟問題［1-2］。

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（本文編輯：趙麗潔）

STUDY OF RELATIONSHIP BETWEEN INTESTINAL NORMAL FLORA AND CD3+CD8-IL-17+IN CHILDREN W ITH ASTHMATOID BRONCHITIS

FANG Qian，LIANG Qinghong，HAO Mingming，WANG Ye，ZHANG Lin*
（Department of Pediatrics，the Third Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050051，China）

Objective To investigate the variations of intestinal flora and the relationship between intestinal flora and CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatoid bronchitis.MethodsForty-seven children with asthmatoid bronchitis，forty chilidren with acute tracheitis and forty-three healthy children were selected in the corresponding time period.The bifidobacteria and E.coli DNA in fecal samples were detected by fluorogenic quantitative polymerase chain reaction.The percentage of CD3+CD8-IL-17+cells in peripheral blood mononuclear cellswere detected by flow cytometrie analysis. Interleukin-17（IL-17）in plasma was detected by enzyme linked immunosorbent assay.Results①The quantity of fecal bifidobacteria and bifidobacteria/E.coli（B/E）values in children with asthmatoid bronchitis and acute tracheitiswere lower than those in healthy children（P＜0.05）；The quantity of fecal bifidobacteria and B/E values in children with asthmatoid bronchitis were lower than those in childrenwith acute tracheitis（P＜0.05）.②The percentage of CD3+CD8-IL-17+cells and the IL-17 level in children with asthmatoid bronchitis and acute tracheitiswere higher than those in healthy children（P＜0.05）.The percentage of CD3+CD8-IL-17+cellswere higher in children with asthmatoid bronchitis，but the IL-17 level was lower than that in children with acute tracheitis（P＜0.05）.③There was a positive linear corelation between the percentage of CD3+CD8-IL-17+cells and the IL-17 level in children with asthmatic bronchitis and acute tracheitis.Therewas a negative linear corelation between B/E ratio and the percentage of CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatic bronchitis.ConclusionThe construction of intestinal flora in children with asthmatoid bronchitis were disordered and intestinal microbial colonization resistance decreased；CD3+CD8-IL-17+cells in children with asthmatoid bronchitis are involved in the early period of disease and play an important role in the pathogenesis of asthmatoid bronchitis.

bronchitis；bifidobacteria；escherichia coli

R725.6

A

1007-3205（2013）08-0908-04

2013-03-18；

2013-04-15

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目（20120103）

方騫（1986-），女，河南南陽人，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事兒科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：Lzhang79@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.014