高雪峰，宋 寧，吳建玲，張瑞芳，段 林，郭憲立

（1.河北省正定縣人民醫(yī)院內(nèi)科，河北正定050800；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北石家莊050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院急診科，河北，石家莊050000）

·論 著·

咯利普蘭抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎間質(zhì)性肺疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞體外增殖

高雪峰1，宋 寧2*，吳建玲2，張瑞芳2，段 林2，郭憲立3

（1.河北省正定縣人民醫(yī)院內(nèi)科，河北正定050800；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北石家莊050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院急診科，河北，石家莊050000）

目的探討選擇性磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）4抑制劑咯利普蘭對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎間質(zhì)性肺疾?。╮heumatoid arthritis-interstitial lung disease，RA-ILD）患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）體外增殖的影響及機(jī)制，為選擇性PDE4抑制劑治療RA-ILD提供理論依據(jù)。方法采集20例初治活動(dòng)期RA-ILD患者的PBMC，采用四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）比色法檢測RA-ILD患者不同濃度咯利普蘭處理的PBMC的增殖活性，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65核染色陽性細(xì)胞百分率。結(jié)果咯利普蘭劑量依賴性抑制RA-ILD患者PBMC的增殖活性，并降低NF-κB p65核染色陽性細(xì)胞百分率（P＜0.01）。結(jié)論咯利普蘭可能通過抑制NF-κB活化抑制RA-ILD患者PBMC的增殖活性，具有治療RA-ILD的潛能。

關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；肺疾?。豢├仗m；細(xì)胞增殖

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以多發(fā)性、對稱性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕卣鞯穆?、進(jìn)行性、炎性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，見于1％美國人［1］，我國患病率為0.32％～0.36％［2］。RA患者易于罹患間質(zhì)性肺疾?。╥nterstitial lung disease，ILD），其患病風(fēng)險(xiǎn)約為非RA者的8.96倍［3］。RAILD缺乏有效治療手段，近年發(fā)現(xiàn)，選擇性磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）4抑制劑可通過抑制PDE活性抑制細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）降解，起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，有望用于RA治療［4］。本研究探討選擇性PDE4抑制劑咯利普蘭對RA-ILD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）體外增殖的影響及機(jī)制，旨在為選擇性PDE4抑制劑治療RA-ILD提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2010年1月—2012年12月于河北省正定縣人民醫(yī)院內(nèi)科門診及住院期間確診為RA-ILD初治患者20例，其中男性9例，女性11例，年齡36～72歲，平均（54.30±10.00）歲，均為活動(dòng)期。RA診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)關(guān)于RA的診治指南［2］；ILD的診斷參照2000年美國胸科協(xié)會(huì)/歐洲呼吸協(xié)會(huì)（American Thoracic Society/European Respiratory Society，ATS/ERS）提出的肺間質(zhì)纖維化的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。RA-ILD患者均排除其他結(jié)締組織病相關(guān)的ILD，包括系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、干燥綜合征、混合性結(jié)締組織病、強(qiáng)直性脊柱炎；排除其他肺部疾病，包括肺炎、肺結(jié)核、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺疾病及肺癌；除外其他因素引起的ILD；除外長期吸煙和使用激素及免疫抑制劑者。研究符合正定縣人民醫(yī)院人體試驗(yàn)委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到該委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器：四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、植物血凝素（plant haemagglutinin，PHA）、咯利普蘭、地塞米松為Sigma公司產(chǎn)品；人外周血淋巴細(xì)胞分離液為天津市灝洋生物制品科技有限公司產(chǎn)品；兔多抗核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65由Santa Cruz公司提供；二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG由中杉金橋公司提供；二氨基聯(lián)苯胺顯色劑由北京中山生物技術(shù)公司提供。RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司提供，胎牛血清為北京圣馬元亨生物技術(shù)研究所提供。

1.3 PBMC的分離和培養(yǎng)：晨間空腹無菌條件下抽取10mL靜脈血，注入抗凝的離心管中，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMC，臺盼藍(lán)染色示活細(xì)胞率＞95％，細(xì)胞總量約5×106個(gè)。

1.4 分組和干預(yù)：取RA-ILD患者的PBMC按1×106個(gè)/mL接種于96孔板，0.1mL/孔。細(xì)胞接種后分別加入終濃度為1×10-7mol/L（組1）、1×10-6mol/L（組2）、1×10-5mol/L（組3）、1×10-4mol/L（組4）的咯利普蘭、1×10-6mol/L地塞米松（組5），對照組不加藥液，僅加入等體積溶媒，總體積0.2mL/孔。調(diào)零孔不加細(xì)胞懸液，只加含10％胎牛血清RPMI-1640 0.2mL。

1.5 MTT比色法檢測PBMC增殖活性：細(xì)胞分組藥物干預(yù)4h后洗去藥液，用10mg/L PHA刺激，于5％CO2，37℃，95％濕度條件下培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT（5g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMSO終止反應(yīng)，振蕩搖勻，酶標(biāo)儀檢測吸光值。選擇測定波長570nm，參考波長655nm。細(xì)胞生長抑制率（％）=（1-實(shí)驗(yàn)孔OD570/對照孔OD570）×100％。

1.6 多聚物標(biāo)記（power vision，PV）免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測NF-κB p65蛋白表達(dá)率：細(xì)胞分組藥物干預(yù)4h后洗去藥液，用10mg/L PHA刺激，于5％CO2，37℃，95％濕度條件下培養(yǎng)1.5h后應(yīng)用細(xì)胞涂片離心機(jī)將收集的細(xì)胞懸液涂于3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷處理過的載玻片上，自然干燥，冷冰酮固定10min。操作按PV免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定，顯微鏡下觀察NF-κB p65蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。低倍鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。計(jì)算出陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率。細(xì)胞核陽性著色百分率可簡便而直觀地反映出NF-κB p65的表達(dá)率。NF-κB p65表達(dá)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)孔NF-κB p65表達(dá)率/對照孔NF-κB p65表達(dá)率）×100％。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以±s表示，分別采用F檢驗(yàn)和q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 咯利普蘭抑制PHA誘導(dǎo)的RA-ILD-PBMC增殖活性：不同劑量的咯利普蘭處理后，RA-ILD患者PBMC的增殖活性較對照組均有不同程度的降低（P＜0.01），且呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，1×10-7mol/L咯利普蘭對PBMC的增殖即有抑制作用，1× 10-4mol/L時(shí)抑制率最高；相同濃度時(shí)，咯利普蘭對PBMC的抑制作用不及激素（P＜0.01），但當(dāng)濃度增加時(shí)，其對PBMC的抑制作用與較低濃度地塞米松相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 咯利普蘭抑制PHA：誘導(dǎo)的RA-ILD-PBMC NF-κB p65表達(dá)：不同劑量的咯利普蘭處理后，RAILD-PBMC NF-κB p65較對照組均有不同程度的降低（P＜0.01），且呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，1×10-7mol/L咯利普蘭對NF-κB p65的表達(dá)即有抑制作用，1×10-4mol/L時(shí)抑制率最高；相同濃度時(shí)，咯利普蘭對NF-κB p65的抑制作用不及激素（P＜0.01），但當(dāng)濃度增加時(shí)，其對NF-κB p65表達(dá)的抑制作用與較低濃度地塞米松相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 咯利普蘭抑制PHA刺激的RA-ILD-PBMC體外增殖及NF-κB表達(dá)Table 1 Rolipram inhibited RA-ILD-PBMC proliferation and expression of NF-kappa B stimulated by PHA in vitro（n=20，±s）

表1 咯利普蘭抑制PHA刺激的RA-ILD-PBMC體外增殖及NF-κB表達(dá)Table 1 Rolipram inhibited RA-ILD-PBMC proliferation and expression of NF-kappa B stimulated by PHA in vitro（n=20，±s）

*P＜0.01 vs control #P＜0.01 vs group 1 △P＜0.01 vs group 2 ☆P＜0.01 vs group 3 by q test

Groups Interventions OD570 value Growth inhibition ratio（％）NF-κB positive rate（％）NF-κB inhibition rate（％）Control 0+PHA10mg/L 0.501±0.052-58.091±5. 49.23±9.18 328-Group 1 1×10-7mol/L rolipram+PHA10mg/L 0.456±0.310*8.09±12.21 50.001±2.845*13.32±8.41 Group 2 1×10-6mol/L rolipram+PHA10mg/L 0.383±0.042*#22.86±10.44 44.529±4.333*#23.01±7.59 Group 3 1×10-5mol/L rolipram+PHA10mg/L 0.331±0.038*#△33.33±10.27 37.144±3.655*#△35.52±8.70 Group 4 1×10-4mol/L rolipram+PHA10mg/L 0.259±0.038*#△☆47.85±8.87 30.259±3.465*#△☆47.62±6.83 Group 5 1×10-6mol/L dexamethason+PHA10mg/L 0.257±0.043*#△☆48.29±9.33 29.346±4.940*#△☆

3 討 論

關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生，形成血管翳，侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失［2］。關(guān)節(jié)滑膜炎是RA的主要表現(xiàn)，包括肺部病變的關(guān)節(jié)外病變可明顯增加RA的致殘率和病死率。RA肺部病變多種多樣，其中ILD最具破壞性，可由發(fā)病最初的亞臨床間質(zhì)性肺炎逐漸發(fā)展為終末期肺纖維化，預(yù)后極差，可因呼吸衰竭而死亡。目前關(guān)于RA-ILD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，缺乏有效的治療藥物，因此，對RA-ILD病因病機(jī)及治療藥物的研究越來越受到關(guān)注［6］。

RA-ILD的發(fā)病機(jī)制不清，多種因素包括遺傳、環(huán)境、藥物治療等參與了RA-ILD的發(fā)病，這些因素可激活針對肺組織的自身免疫炎癥反應(yīng)，多種免疫炎癥細(xì)胞活化，釋放細(xì)胞因子、促纖維化因子，啟動(dòng)并介導(dǎo)了肺組織纖維化不斷進(jìn)展［6］。因此，針對免疫炎癥反應(yīng)的抗炎治療是研發(fā)RA-ILD治療藥物的方向之一。

PDE是一類催化水解cAMP使其轉(zhuǎn)變?yōu)槭セ钚缘膯魏烁仕岬年P(guān)鍵酶，是cAMP水解的惟一途徑，因此，PDE的活性是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的重要因素。cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與了多種免疫炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，抑制PDE活性可提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，從而抑制免疫炎癥反應(yīng)［6］。PDE是一個(gè)超級酶家族，根據(jù)其氨基酸序列不同、酶動(dòng)力學(xué)特征及對底物的特異性不同，可將其分為PDE1～11共11個(gè)家族，它們在不同細(xì)胞中表現(xiàn)出特有的功能，其中PDE4廣泛分布于免疫炎癥細(xì)胞，已證實(shí)選擇性PDE4抑制劑具有較強(qiáng)的抗炎活性，可防治多種免疫炎癥性疾?。?］，選擇性PDE4抑制劑羅氟司特已經(jīng)美國食品藥品管理局批準(zhǔn)上市用于治療慢性阻塞性肺疾?。?］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)選擇性PDE4抑制劑咯利普蘭具有防治關(guān)節(jié)病變及肺纖維化的作用［8-9］，我們在前期研究中也證實(shí)咯利普蘭能下調(diào)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠致炎因子、上調(diào)抗炎因子，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡并改善受損的肺功能［10］，但其是否對RA-ILD患者具有抗炎作用尚未見報(bào)道。

本研究采集RA-ILD患者的PBMC進(jìn)行體外培養(yǎng)，并給予PHA促進(jìn)其體外增殖，同時(shí)給予不同濃度的咯利普蘭予以干預(yù)，且與地塞米松相對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，咯利普蘭劑量依賴性地抑制PHA誘導(dǎo)的PBMC體外增殖及NF-κB表達(dá)，在1×10-7mol/L即有效，并隨著劑量的倍增對PBMC增殖及NF-κB表達(dá)的抑制率逐漸增加，以1×10-4mol/L濃度時(shí)最為明顯，雖然相同濃度的咯利普蘭對PBMC的抑制率不及激素，但當(dāng)劑量達(dá)到一定水平時(shí)，其對PBMC活性的抑制能夠達(dá)到與激素相當(dāng)?shù)乃健?/p>

NF-κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)能調(diào)節(jié)多種炎癥和免疫基因表達(dá)的重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。NF-κB通常是由p50和p65組成的異二聚體，可通過檢測p65的表達(dá)反映NF-κB活性變化［11］。本研究發(fā)現(xiàn)PBMC活化增殖時(shí)，伴隨著NF-κB活性增強(qiáng)，應(yīng)用咯利普蘭可抑制NF-κB活化，同時(shí)伴有PBMC增殖活性的減低，提示抑制NF-κB活化轉(zhuǎn)位入核可能是咯利普蘭抑制PBMC體外增殖的作用機(jī)制之一。已有研究［12］證實(shí)增強(qiáng)cAMP活性可抑制NF-κB活化，咯利普蘭抑制RA-ILD-PBMC內(nèi)NF-κB，推測與其抑制PDE4、減少cAMP降解、提高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度有關(guān)。

綜上所述，咯利普蘭可能通過抑制NF-κB活化抑制RA-ILD患者PBMC的體外增殖活性。作為新的抗炎藥物，選擇性PDE4抑制劑在RA-ILD防治中的作用值得我們關(guān)注并深入研究。

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（本文編輯：趙麗潔）

ROLIPRAM INHIBITS ACTIVITY OF PROLIFERATION IN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS FROM RHEUMATOID ARTHRITIS PATIENTS
W ITH INTERSTITIAL LUNG DISEASE AND ITSMECHANISM

GAO Xuefeng1，SONG Ning2*，WU Jianling2，ZHANG Ruifang2，DUAN Lin2，GUO Xianli3
（1.Department of Internal Medicine，the People's Hospital of Zhengding County，Hebei Province，Zhengding 050800，China；2.Department of Respiratory Medicine，the Second Hospital of HebeiMedical University，
Shijiazhuang 050000，China；3.Department of Emergency，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

arthritis，rheumatoid；lung diseases；rolipram；cell proliferation

Objective To investigate the effect of selective phosphodiesterase（PDE）4 inhibitor rolipram on activity of proliferation in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）from rheumatoid arthritis patients with interstitial lung disease（RA-ILD）and its mechanism.MethodsPBMC isolated from 20 patients with untreated active RA-ILD were cultured in vitro.The activity of proliferation in PBMC was detected by methyl thiazolyl blue tetrazolium bromide（MTT）spectrophotometry and the expression of nuclear factor（NF）-κB was determined by immunocytochemical staining.ResultsRolipram inhibited PBMC proliferation activity，and reduced NF-κB p65 nuclear staining positive percentage in a dose-dependentmanne（r P＜0.01）.ConclusionRolipram may inhibit the proliferation activity of PBMC through the inhibition of NF-κB activation in RA-ILD patients，whichsuggests that selective PDE 4 inhibitors have a potential for the treatment of RA-ILD.

2013-03-25；

2013-04-27

河北省科技廳科技支撐計(jì)劃（10276105D-50）；河北省2011年醫(yī)學(xué)科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目計(jì)劃（20110334）

高雪峰（1975-），男，河北正定人，河北省正定縣人民醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事呼吸系統(tǒng)疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：songning1972@qq.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.006

R593.22

A

1007-3205（2013）08-0884-04< class="emphasis_bold">ABSTRACT：Objective