楊華偉，劉劍侖，李景濤，劉起鵬，韋 薇，唐 瑋，蔣 奕

（廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科，南寧530021）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其復發(fā)轉(zhuǎn)移是乳腺癌死亡的最主要原因［1］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）的表達異常與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2］。但LOX在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制尚不清楚。本研究組前期結(jié)果提示，LOX可以促進乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，LOX基因在高侵襲潛能的乳腺癌細胞MDA-MB-231中高表達，在低侵襲性MCF-7細胞中低表達［3］。本研究通過構(gòu)建LOX慢病毒干擾載體（LOX-RNAi-LV），抑制高侵襲轉(zhuǎn)移乳腺癌細胞MDA-MB-231中LOX基因表達，并檢測LOX、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和 低 氧 誘 導 因 子-1α（hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）的表達變化，通過乳腺癌裸鼠移植瘤模型分析LOX蛋白與MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白相關(guān)性，探討LOX在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人乳腺癌細胞MDA-MB-231購于南京凱基生物技術(shù)有限公司；人乳腺癌MCF-7細胞由廣西醫(yī)科大學基礎(chǔ)實驗室饋贈；LOX-RNAi-LV由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司構(gòu)建包裝；Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司；Quant SYBR Green PCR試劑盒為北京TianGen公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；熒光定量PCR為美國Bio-Rad，iQTM5Multicolor；LOX兔抗人多克隆抗體購自美國Novus生物公司；病理圖像分析儀DMR＋550為德國萊卡公司。

1.2 LOX-RNAi-LV的構(gòu)建 由Ambition公司設(shè)計、合成針對人LOX基因的siRNA，序列如下，上游引物：GGA ACU UUA GUG AAA CAU AAU，下游引物：UAU GUU UCA CUA AAG UUC CAG。合成含干擾序列的雙鏈DNA oligo，其兩端含酶切位點粘端，直接連入酶切后的載體pGCL-GFP（含U6啟動子）上。驗證后進行病毒包裝，檢測滴度和復感染指數(shù)后進行細胞轉(zhuǎn)染干擾實驗。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人乳腺癌細胞MDA-MB-231培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的3×105個細胞／孔接種于6孔板中，待細胞覆蓋率達70%時進行轉(zhuǎn)染，干擾組加入1.5×108TU／mL病毒液LOX-RNAi-LV 30μL，陰性對照組加入1.5×108TU／mL GFP-NC-LV 30μL，空白對照組除不作轉(zhuǎn)染外其余處理與以上各組相同。每組設(shè)3個平行孔，分別于感染24、48、72、96h后，觀察熒光表達情況。

1.4 轉(zhuǎn)染72h后實時熒光定量PCR檢測LOX mRNA，MMP-2mRNA，MMP-9mRNA及HIF-1αmRNA表達 Trizol法提取各組細胞總RNA，檢測細胞總RNA濃度，取2μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列：MMP-2上游引物：TGC CCA AGA ATA GAT GCT GAC，下游引物：GAA AGG AGA AGA GCC TGA AGT G，長度160bp；MMP-9上游引物：CTT CTG CCC GGA CCA AGG ATA C，下游引物：TTC AGG GCG AGG ACC ATA GAG G，長度187bp；HIF-1α，上游引物：CCA GTT ACG TTC CTT CGA TCA GT，下游引物：TTT GAG GAC TTG CGC TTT CA，長度74bp；LOX上游引物：CAG GCA CCG ACC TGG ATA TGG，下游引物：CGT ACG TGG ATG CCT GGA TGT AGT，長度193bp；β-actin上游引物：AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G，下游引物：CAC CTT CAC CGT TCC AGT TTT，長度148bp。Real-time PCR按Quant SYBR Green PCR試劑盒說明書操作，每例樣品各做3個平行管，在實時熒光定量基因擴增儀進行擴增。反應(yīng)條件：MMP-2：預變性95℃2min，變性95℃30s，退火58℃30s，40個循環(huán)，延伸72℃31s。MMP-9：預變性95℃5min，變性95℃45s，退火59℃30s，40個循環(huán)，延伸72℃31s。HIF-1α：預變性95℃3min，變性95℃30s，退火57℃30s，40個循環(huán)，延伸72℃31s。LOX：預變性94℃3min，變性94℃30s，退火59℃30s，40個循環(huán)，72℃31s。讀取Ct值，參照文獻比較閾值法計算［4］：首先按公式“△Ct＝CT平均值（LOX）-CT平均值（β-actin）”分別計算對照組和干擾組的△CT，再按公式“ΔΔCT＝ΔCT干擾組-ΔCT對照組”得到“2-ΔΔCT”代 表目 的 基 因 相 對 表達 量。（1-2-ΔΔCT）×100% 為LOX基因表達抑制率。

1.5 轉(zhuǎn)染72h后 Western blot檢測LOX蛋白表達 提取MDA-MB-231細胞總蛋白，操作步驟按照RIPA裂解液使用說明進行，并用BCA法測定蛋白濃度。取10μL約30μg的總蛋白進行10%SDS-PAGE電泳后，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，一抗、二抗標記，電化學發(fā)光法顯影。LOX蛋白與β-actin蛋白條帶的灰度比值反映LOX蛋白的相對表達水平。

1.6 乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型的建立 實驗裸鼠隨機分為3組，每組20只，分別接種MDA-MB-231、MCF-7及干擾LOX基因表達的MDA-MB-231細胞［3］。取對數(shù)生長的上述3種細胞，細胞濃度為1.0×108／mL。抽取3種細胞懸液各0.1mL分別注入60只祼鼠的乳腺脂肪墊內(nèi)。接種后6周，裸鼠頸椎脫位致死做后續(xù)試驗。

1.7 免疫組織化學法檢測LOX、MMP-2、MMP-9及 HIF-1α蛋白表達 免疫組織化學采用標記的鏈霉素抗生物素蛋白-生物素免疫染色（streptavidin peroxidase，SP）方法，實驗步驟按說明書進行。以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.8 免疫組織化學染色結(jié)果判斷 LOX、MMP-2及 MMP-9染色以細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，HIF-1α蛋白的表達部位主要在細胞核，呈棕黃色顆粒為陽性。隨機選擇10個高倍（×400）視野，根據(jù)腫瘤細胞著色數(shù)量多少，半定量分為4級：無著色為陰性（-），陽性細胞小于25%為弱陽性，陽性細胞25%～50%為中度陽性（＋＋），陽性細胞大于50%為強陽性（＋＋＋）。

1.9 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均以±s表示。采用配對樣本t檢驗、Spearman等級相關(guān)、兩獨立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗、多個獨立樣本比較Kruskal-Wallis H秩和檢驗進行分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測 LOX-RNAi-LV轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞株MDA-MB-231，60h后有GFP熒光表達，72h后表達明顯增強，熒光表達率達90%。

2.2 實時熒光定量PCR檢測各組LOX mRNA、MMP-2mRNA、MMP-9mRNA及HIF-1αmRNA表達 樣品mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR儀分析獲得目的基因和內(nèi)參β-actin擴增片段的Ct值、擴增曲線和融解曲線。轉(zhuǎn)染72h后，轉(zhuǎn)染組LOX mRNA相對表達量與空白組比較，干擾組的LOX mRNA被抑制，抑制率達89.2%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，干擾組MMP-2、MMP-9mRNA相對表達量均明顯低于陰性組和空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P＝0.000）。

圖1 Western blot檢測轉(zhuǎn)染LOX-RNAi-LV后各組LOX蛋白的表達情況

表1 各組LOX蛋白表達水平（±s）

表1 各組LOX蛋白表達水平（±s）

＊：P＜0.05，與陰性對照組及空白組比較。

組別 條帶光密度相對比值LOX／β-actin轉(zhuǎn)染組 0.156±0.004＊空白組 0.916±0.007陰性對照組0.696±0.020

2.3 Western blot檢測各組LOX蛋白表達 轉(zhuǎn)染72h后，干擾組的LOX蛋白水平與空白組和陰性對照組比較明顯被抑制，抑制率達82.97%（圖1、表1）。

2.4 免疫組織化學法檢測LOX及相關(guān)因子的蛋白表達 取體內(nèi)裸鼠移植瘤標本，用免疫組織化學法分別檢測MDA-MB-231組、MDA-MB-23（LOX干擾）組、MCF-7組中LOX、MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白的表達情況。

2.4.1 LOX蛋白在裸鼠移植瘤組織中的表達 LOX蛋白主要表達于胞核、胞漿中出現(xiàn)棕色顆粒為陽性（圖2），LOX蛋白在 MDA-MB-231組、MDA-MB-231（LOX干擾）組、MCF-7組中表達情況，見表2。

表2 LOX、MMP-2、MMP-9、HIF-1а蛋白在3組的表達情況 比較

2.4.2 MMP-2蛋白在裸鼠移植瘤組織中的表達 MMP-2蛋白主要表達在細胞漿（圖3）。MMP-2蛋白在 MDA-MB-231組、MDA-MB-231（LOX干擾）組、MCF-7組中的表達情況，見表2。

2.4.3 MMP-9蛋白在裸鼠移植瘤組織中的表達 MMP-9蛋白主要表達在細胞漿。MMP-9蛋白在MDA-MB-231組、MDA-MB-231（LOX干擾）組、MCF-7組中的表達情況，見表2。

圖2 裸鼠移植瘤LOX（＋＋＋）陽性表達免疫組織化學影像學表現(xiàn)（SP，×400）

2.4.4 HIF-1α蛋白在裸鼠移植瘤組織中的表達 HIF-1α蛋白的表達部位主要在細胞核。HIF-1α蛋白在 MDA-MB-231組、MDA-MB-231（LOX干擾）組、MCF-7組中的表達情況，見表2。

2.5 LOX蛋白與 MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示LOX蛋白與 MMP-2（r＝0.696，P＝0.000）、MMP-9（r＝0.735，P＝0.000）、HIF-1α（r＝0.737，P＝0.000）蛋白呈顯著正相關(guān)。

圖3 裸鼠移植瘤MMP-2（＋＋＋）陽性表達免疫組織化學影像學表現(xiàn)（SP，×400）

3 討 論

LOX是一種銅依賴性氧化酶，是細胞外基質(zhì)中膠原與彈性蛋白聚合起始階段并穩(wěn)定細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的關(guān)鍵酶［5］。研究表明LOX表達與乳腺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)［6］，在乳腺癌、食管癌、頭頸部惡性腫瘤和黑色素瘤中高表達［7-9］。腫瘤細胞中表達上調(diào)的LOX，能夠促進腫瘤細胞擴散到其他組織器官，腫瘤組織缺氧提示癌細胞的生長和分裂速度快，HIF-1可誘導LOX mRNA活性增高，可能是導致癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要原因［10］。腫瘤細胞實現(xiàn)其侵襲轉(zhuǎn)移必須解除細胞外基質(zhì)的束縛，這有賴于基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo-proteinases，MMPs）、組 織 蛋 白 酶 （cathepsins）等，MMP-2、MMP-9能降解Ⅳ型膠原，MMPs促進乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的機制與降解細胞外基質(zhì)、促進血管生成及調(diào)節(jié)細胞黏附有關(guān)，而MMP-2和MMP-9蛋白的高表達使其相應(yīng)的特異性抑制劑的表達失去平衡，導致基底膜的主要成分（Ⅳ型、Ⅶ型、Ⅹ型膠原和明膠）被降解［11-12］。Erler等［13-14］不但發(fā)現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞株中LOX表達上調(diào)，LOX反義寡聚核苷酸或LOX小分子抑制劑能抑制乳腺癌細胞株的侵襲能力，還發(fā)現(xiàn)LOX不僅介導了侵襲轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞株MDA-MB-231對膠原Ⅰ基質(zhì)的侵襲作用，而且引起MMPs的活性增強，同時發(fā)現(xiàn)乳腺癌、頭頸癌患者腫瘤組織的低氧狀況與LOX表達水平明顯相關(guān)，認為LOX mRNA通過LOX啟動子中功能性低氧反應(yīng)元件受到HIF-1α的調(diào)控。LOX可能是一個低氧反應(yīng)基因［15］。

本研究采用LOX-RNAi-LV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后，干擾組LOX mRNA和LOX蛋白與陰性對照組和空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明LOX-RNAi-LV轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細胞LOX mRNA和LOX蛋白表達受到顯著抑制。同時，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，干擾組MMP-2、MMP-9及HIF-1α及基因表達與空白組和陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明抑制了LOX的表達其MMP-2及MMP-9、HIF-1α及Ki-67的表達同時也受到了明顯的抑制；乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7和LOX基因干擾的裸鼠移植瘤模型中 MDA-MB-231組LOX、MMP-2、MMP-9及HIF-1α蛋白表達水平明顯高于LOX基因干擾組及MCF-7組，而且LOX的表達與 MMP-2、MMP-9及HIF-1α成顯著正相關(guān)。

作者推測可能是由于MMPs水解ECM，松解了致密的膠原基質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進腫瘤細胞移行，而LOX的過表達改變了腫瘤細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，激活某些特定信號傳導通路，上調(diào)了MMPs的表達，MMPs通過降解基底膜，去除了腫瘤細胞侵蝕和轉(zhuǎn)移的物理屏障，破壞了血管壁的完整性，同時增加了微血管的通透性，介導內(nèi)皮細胞遷移和侵蝕，誘導新生血管形成，從而促進了乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移；而且低氧環(huán)境影響下上調(diào)LOX的表達，刺激乳腺癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。LOX和 MMP-2、MMP-9及HIF-1α轉(zhuǎn)移因子可能具有協(xié)同促進作用，促進了乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，進一步探索LOX在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的可能作用機制，將有助于更好地闡述乳腺癌的生物學行為。

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