楊俊發(fā)，柴曉宇，許 飛

（1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌330006）

非典型肺部感染以呼吸道為主要感染途徑，病原體以肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）、肺炎衣原體（chlamydia pneumoniae，CP）、嗜肺軍團(tuán)菌（legionella pneumophila，LP）為主，臨床表現(xiàn)可為輕、重不等的感染癥狀，特別是并發(fā)重癥肺炎，預(yù)后差［1］。及早明確引起非典型肺部感染的病原菌，對(duì)臨床醫(yī)生制訂診治決策、指導(dǎo)針對(duì)性用藥起重要作用。但現(xiàn)階段臨床上對(duì)這幾種病原體的檢測(cè)還處于相對(duì)滯后的局面［2］，所以，開發(fā)一套可以快速準(zhǔn)確檢測(cè)這3種病原體的方法是臨床檢測(cè)工作中亟待解決的問題。

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）［3-4］具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、靈敏度及特異性好等優(yōu)點(diǎn)，近年來發(fā)展迅速，已被廣泛應(yīng)用于核酸擴(kuò)增領(lǐng)域。病原微生物基因組計(jì)劃的進(jìn)展，使基因診斷病原微生物感染成為可能，基因芯片雜交技術(shù)是在此基礎(chǔ)上新興的一種高通量技術(shù)，即在面積較小的載體上實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目標(biāo)基因的同時(shí)檢測(cè)［5］。本研究擬采用LAMP技術(shù)對(duì)引起非典型肺部感染的3種常見病原體的特異基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，并結(jié)合基因芯片雜交技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的檢測(cè)，以求開發(fā)一套可以快速檢測(cè)非典型肺部感染的病原體的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種標(biāo)準(zhǔn)DNA來源 嗜肺軍團(tuán)菌DNA獲贈(zèng)于北京基因組研究所，肺炎支原體及肺炎衣原體DNA為本實(shí)驗(yàn)室保存品。

1.1.2 標(biāo)本來源 篩選2009年3月至2010年9月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科、江西省兒童醫(yī)院等醫(yī)院門診就診及住院的疑似肺部感染者，根據(jù)臨床相關(guān)診斷和排除標(biāo)準(zhǔn)，選取非典型肺部感染及重癥肺炎患者為標(biāo)本來源，標(biāo)本為痰、血配對(duì)標(biāo)本，共110份，編號(hào)后在適宜溫度下保存。

1.1.3 主要試劑、儀器 試劑：2×PCR TaqMix（Tiangen Biotech）、Bst DNA 聚合酶（New England BioLabs公司）、Betaine（Sigma公司）、20×smart green（Biotium 公司）、DNA Marker 500bp、抽提液、預(yù)雜交液、雜交緩沖液、洗脫液、抗體液、顯色液（上海百傲科技有限公司）。儀器：Biometra PCR儀、美國BIO-RAD公司電泳儀、Alphalmager EC紫外成像系統(tǒng)、Omni GridTM100microarrayer點(diǎn)樣儀、Gene Pix 4000B共聚焦激光掃描儀、GenePixPro6.0圖像掃描和分析軟件。

1.1.4 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌的基因序列分析特異基因片段，并據(jù)其設(shè)計(jì)特異性LAMP引物及探針，在引物上游的5′端標(biāo)記生物素Biotin［6］。引物及探針均由上海生工生物有限公司合成。

1.1.5 探針的設(shè)計(jì)與合成 使用生物工程手段，根據(jù)上述各病原菌特異基因片段設(shè)計(jì)探針并進(jìn)行Blast特異性比對(duì)，在探針的5′端連接Poly（T），以確保探針之間的特異性，探針序列此處從略。引物及探針均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 痰標(biāo)本DNA制備 在痰標(biāo)本中1∶1加入等量混勻的痰消化酶懸液（濃度5%，pH為8），混勻后靜置30min，充分液化至無痰絲。吸取0.5mL入離心管中，10 000r／min離心5min，棄上清液，沉淀加生理鹽水1mL。振蕩洗滌沉淀后10 000r／min離心5min。如此2次，棄上清液，沉淀物按照DNA提取試劑盒步驟提取DNA，提取物編號(hào)后在-80℃條件下保存。

1.2.2 LAMP擴(kuò)增 配置肺炎支原體、肺炎衣原體及嗜肺軍團(tuán)菌3種病原菌LAMP引物 Mix：F3（50μm）4μL，B3（50μm）4μL，F(xiàn)IP（50μm）16μL，BIP（50μm）16μL，ddH2O 50μL混勻備用。取薄壁PCR管（0.2mL），向各管中加入：2×ULAMP Mix（10μL）、引物 Mix（1μL）、模板 DNA（2μL）、Bst酶（0.8μL）、ddH2O（6.2μL），混勻，置于 PCR 儀中，溫度-時(shí)間設(shè)置為60℃60min，80℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)品純化。

1.2.3 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè) 將LAMP反應(yīng)后的PCR管置于12 000r／min離心機(jī)中離心1min。先肉眼觀察反應(yīng)管是否有沉淀生成，將產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳25min，于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物是否呈帶條狀帶［7］。

1.2.4 芯片制備 上述合成的探針用DMSO探針稀釋調(diào)整濃度至30μmol／L，使用醛基化玻片進(jìn)行點(diǎn)樣，點(diǎn)樣矩陣見圖1，將點(diǎn)樣玻片置于Omni GridTM100microarrayer點(diǎn)樣儀中，設(shè)置點(diǎn)樣程序，將每個(gè)樣品點(diǎn)成4×4的矩陣，每個(gè)芯片上可以容納32個(gè)矩陣（點(diǎn)樣后在室溫中干燥10min，晾置過夜，紫外交聯(lián)儀固定，44℃干燥10min）。陽性對(duì)照（PC）選用Poly（T）-Biotin，探針稀釋液為空白對(duì)照（BC），基因陰性對(duì)照（NC）選用無同源性的酵母基因。點(diǎn)制好的芯片置于干燥箱中保存?zhèn)溆??；蛐酒缮虾Ｉ镄酒瑖夜こ萄芯恐行狞c(diǎn)制（圖1）。

圖1 探針點(diǎn)樣示意圖

1.2.5 芯片雜交與結(jié)果判讀 取3種病原體的LAMP產(chǎn)物各10μL與200μL雜交緩沖液充分混合，98℃變性10min，瞬即轉(zhuǎn)移至0℃環(huán)境5min；將上述混合物轉(zhuǎn)移至芯片反應(yīng)區(qū)內(nèi)，平鋪均勻，45℃下雜交3h。雜交結(jié)束后，用0.1g／dl SDS，去離子水及無水乙醇分別洗滌芯片1min，晾干。用Gene-Pix4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行芯片掃描，設(shè)置合適的掃描通道和掃描時(shí)間，并運(yùn)行圖像掃描分析軟件分析熒光信號(hào)的強(qiáng)度及結(jié)果判讀［8］。

1.2.6 特異性檢測(cè) 用制備的基因芯片和上述雜交方法，分別對(duì)3種病原體的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和芯片雜交檢測(cè)，驗(yàn)證基因芯片的特異性。

1.2.7 敏感度檢測(cè) 提取標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA并測(cè)定其濃度，將DNA調(diào)整到30ng／μL，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋，即進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)的DNA濃度分別為30ng／μL，30×10-1ng／μL，30×10-2ng／μL，30×10-3ng／μL，30×10-4ng／μL，30×10-5ng／μL，0ng／μL，每個(gè)濃度的 DNA 各取1μL分別進(jìn)行LAMP試驗(yàn)和芯片雜交檢測(cè)。本研究選取嗜肺軍團(tuán)菌DNA進(jìn)行敏感度檢測(cè)。

1.2.8 樣品檢測(cè) 將110份從痰液標(biāo)本提取的核酸進(jìn)行LAMP擴(kuò)增及擴(kuò)增后反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)，后與基因芯片雜交，實(shí)現(xiàn)對(duì)3種病原體的檢測(cè)，將雜交結(jié)果與標(biāo)本LAMP反應(yīng)結(jié)果比較。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP反應(yīng)結(jié)果 所設(shè)計(jì)的3套LAMP引物與相應(yīng)DNA反應(yīng)后均有特異性電泳條帶產(chǎn)生，目標(biāo)片段理想。如將標(biāo)準(zhǔn)肺炎支原體模板與其他對(duì)照DNA加入特異性引物后進(jìn)行LAMP反應(yīng)，能顯示標(biāo)準(zhǔn)肺炎支原體LAMP反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)特異性的白色沉淀（圖2A）。將LAMP反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后觀察，肺炎支原體標(biāo)本出現(xiàn)LAMP特有的階梯狀分布的擴(kuò)增條帶（圖2B）。嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體LAMP反應(yīng)均有同樣表現(xiàn)。上述結(jié)果表明，該反應(yīng)體系能有效地?cái)U(kuò)增目的基因。

圖2 肺炎支原體LAMP反應(yīng)結(jié)果

圖3 嗜肺軍團(tuán)菌LAMP反應(yīng)敏感性結(jié)果

2.2 LAMP檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌敏感性結(jié)果 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)嗜肺軍團(tuán)菌DNA模板進(jìn)行10倍比稀釋，應(yīng)用LAMP方法擴(kuò)增各濃度模板中的相應(yīng)特異基因，反應(yīng)產(chǎn)物電泳后用凝膠紫外分析儀分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品LAMP電泳擴(kuò)增結(jié)果見圖3：LAMP方法在104拷貝大小及以上濃度均有反應(yīng)條帶。

2.3 雜交反應(yīng)判讀結(jié)果 見圖4。根據(jù)布陣探針分布，雜交結(jié)果均顯示較高特異性。陽性對(duì)照雜交信號(hào)強(qiáng)，陰性對(duì)照、空 白對(duì)照始終無信號(hào)出現(xiàn)。

圖4 基因芯片雜交結(jié)果掃描圖

2.4 特異性結(jié)果 將擴(kuò)增產(chǎn)物分別與芯片雜交，檢驗(yàn)3種病原體的特異性，在芯片對(duì)應(yīng)的位置上出現(xiàn)雜交信號(hào)，其他不對(duì)應(yīng)位置無雜交信號(hào)，表明芯片的特異性良好。在LAMP成功擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，使用所設(shè)計(jì)的每一條探針，對(duì)相應(yīng)的菌株DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所設(shè)計(jì)的探針與相應(yīng)的菌株檢測(cè)可以得到正確的檢測(cè)結(jié)果。

2.5 靈敏度分析 分別采用芯片雜交、LAMP兩種方法檢測(cè)病原體的靈敏度。基因芯片檢測(cè)肺炎支原體、肺炎衣原體及嗜肺軍團(tuán)菌的靈敏度分別為3.0×10-4pg／μL、2.25×10-4pg／μL、6.53×10-4pg／μL。通過對(duì)檢測(cè)結(jié)果比較，表明基因芯片的靈敏程度基本與LAMP法相近，可檢測(cè)到10-4pg／μL水平的核酸量。

2.6 臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果 利用基因芯片對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，檢測(cè)到肺炎支原體陽性12份（0.109%）；肺炎衣原體陽性2份（0.018%）；嗜肺軍團(tuán)菌陽性4份（0.036%），結(jié)果與樣品LAMP反應(yīng)結(jié)果符合率為100%。

3 討 論

目前，中國每年下呼吸道感染的發(fā)病人數(shù)在5 000萬人次以上，其中非典型病原體引起的感染占很大比例［9］。臨床上，對(duì)非典型病原體的診斷主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)、抗體檢測(cè)等方法，然而，這些實(shí)驗(yàn)方法存在許多不足：實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，如細(xì)菌培養(yǎng)需要3d才能出結(jié)果，支原體及衣原體的抗體檢測(cè)只能作為回顧性診斷；病原體培養(yǎng)困難，如軍團(tuán)菌的培養(yǎng)，現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室還難以做到；而ELISA、熒光雜交方法敏感性及特異性較差，且價(jià)格昂貴［10］，不適合在各級(jí)醫(yī)院普遍展開。

基因芯片技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、高通量、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)［11］，運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)致病菌的同類研究已有報(bào)道。近年來，隨著LAMP技術(shù)在中國的發(fā)展以及基因芯片技術(shù)的不斷完善，對(duì)肺部非典型感染的病原體檢測(cè)有了新的思路。本研究根據(jù)LAMP原理，針對(duì)常見的肺部非典型感染病原體基因保守序列設(shè)計(jì)引物，在選擇基因保守序列方面，通常選用的病原菌16SrRNA序列差異很小，因此，用此序列做靶基因很難準(zhǔn)確鑒別各種病原體［12］，為解決此問題，研究人員選用特異性更強(qiáng)的基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的反應(yīng)引物與序列，經(jīng)驗(yàn)證和篩選后得到最佳的引物，并且通過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)出較為穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件，取得了較滿意的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明該方法能夠更高效準(zhǔn)確地達(dá)成反應(yīng)、檢測(cè)目的。LAMP技術(shù)與基因芯片技術(shù)的整合可以實(shí)現(xiàn)2種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，通過LAMP的基因放大作用和基因芯片的熒光探針雜交技術(shù)可使此種檢測(cè)體系達(dá)到較高的靈敏度和特異度，且LAMP具有恒溫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，無需過多考慮引物退火溫度不統(tǒng)一、操作復(fù)雜等難題。本研究建立的LAMP結(jié)合基因芯片技術(shù)檢測(cè)病原體的方法，具有創(chuàng)新性，經(jīng)研究驗(yàn)證是一種可行的方法，為肺部非典型感染致病菌的檢測(cè)提供了一種可行手段。

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