張紅梅，劉 培，盛春風(fēng)，鄭紅梅

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院：1.呼吸內(nèi)科；2.重癥醫(yī)學(xué)科；3.普外科，湖北十堰442000）

膿毒癥（sepsis）是重癥感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），進(jìn)一步可發(fā)展成為多器官功能衰竭（MODS）［1］。在前期的研究中作者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p38MAPK信號(hào)通路可能是通過(guò)促進(jìn)膈肌肌細(xì)胞凋亡機(jī)制來(lái)參與膿毒癥膈肌損傷，并且給予烏司他丁治療后膈肌損傷減輕，膈肌肌細(xì)胞凋亡率減少。為了進(jìn)一步探討烏司他丁對(duì)膿毒癥膈肌p38MAPK信號(hào)通路的影響，本研究選用成年雄性SD大鼠制作盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）模型，觀察p38MAPK蛋白表達(dá)、肌細(xì)胞凋亡率及肌肉收縮力。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300g，由鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)化數(shù)字法，將大鼠隨機(jī)分為3組，A組（假手術(shù)組，n＝10）、B組（膿毒癥組，n＝10）及C組（烏司他丁治療組，n＝10）。

1.2 CLP模型的建立［2］將購(gòu)來(lái)的SD大鼠在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周以上，實(shí)驗(yàn)前禁食24h，自由飲水。以10%水合氯醛（0.35 mL／100g）腹腔麻醉后固定。假手術(shù)組大鼠沿下腹部中線位置縱行切開長(zhǎng)約2cm切口，尋找到盲腸后輕提起盲腸并將之回納入腹腔，不作任何處理，縫合傷口。B組大鼠在麻醉后切開左頸外動(dòng)脈，留置導(dǎo)管，監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓（mean arterial pressure，MAP），記錄血壓基礎(chǔ)值。手術(shù)分層打開腹腔，尋找到盲腸后提起其末端，暴露回盲部以1.0絲線結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端2／3部分，并用18號(hào)針穿刺盲腸2次，1孔在盲腸末端，1孔在盲腸近端，輕壓盲腸讓少量腸內(nèi)容物排至腹腔內(nèi)。然后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。術(shù)后立即給動(dòng)物皮下注射林格液50 mL／kg體質(zhì)量抗休克。手術(shù)完成后，觀察血壓值變化，當(dāng)所監(jiān)測(cè)血壓值下降幅度超過(guò)基礎(chǔ)值的20%且持續(xù)20min以上時(shí)，即可認(rèn)為達(dá)到早期膿毒性休克標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒ⅲ?］。術(shù)后觀察大鼠的健康情況。

1.3 烏司他丁治療方法 C組大鼠在制作CLP模型后立即給予烏司他丁20 000U腹腔注射，并且于8h后再次給予烏司他丁20 000U腹腔注射。而A組不作任何處理，B組大鼠則在制作模型后立即及8h后給予生理鹽水2mL腹腔注射作為對(duì)照。

1.4 膈肌肌細(xì)胞凋亡率檢查 新鮮膈肌組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。用武漢博士德公司提供的原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒TUNEL法檢測(cè)膈肌細(xì)胞凋亡程度。

1.5 膈肌肌條收縮力檢測(cè) 處死動(dòng)物后，剖腹速取左側(cè)肋膈肌，包括中心腱及肋骨，置于37.8℃，通有95%O2與5%CO2混合氣體的林格氏液浴槽中（pH 7.4）。將膈肌剪成5mm×15mm的肌條。肌條肋骨端固定在浴槽底部，中心腱端連接于經(jīng)過(guò)標(biāo)化校對(duì)的張力換能器上，張力換能器連接于多道生理記錄儀。將肌條置于兩片鉑金電極間，采用刺激儀予以0.5ms單脈沖方波刺激（刺激參數(shù)前負(fù)荷：2g，時(shí)間常數(shù)：DC，高頻濾波：30Hz，增益：10g），每個(gè)刺激間隔2h。初始刺激強(qiáng)度為0.1mA，逐漸增大刺激強(qiáng)度，每次增加0.05mA，當(dāng)?shù)玫降募∪馐湛s力不再增大時(shí)獲得的收縮力為最大收縮力。肌條收縮力＝最大收縮力／肌條橫截面積，橫截面積＝肌條重量（g）／［肌條長(zhǎng)度×肌肉密度（1.056g／cm3）］。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 假實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后一般狀況良好，行動(dòng)自如，呼吸平穩(wěn)，飲食正常。B組大鼠術(shù)后精神萎靡、行動(dòng)遲緩、輕度豎毛、移動(dòng)減少、喜靜臥、群聚減少。A組大鼠腹腔內(nèi)腸管正常或有少量粘連，腸黏膜正常或輕度水腫、充血。B組大鼠腹腔內(nèi)有血性或膿性滲出液，帶惡臭，腸管脹氣，內(nèi)臟充血水腫失去原有光澤，腸黏膜充血水腫明顯。B組血壓值術(shù)后下降幅度超過(guò)基礎(chǔ)血壓值的20%且持續(xù)20min以上。而A組其血壓值術(shù)后沒(méi)有明顯下降。

2.2 p38MAPK蛋白表達(dá)、膈肌肌細(xì)胞凋亡率及膈肌收縮力檢測(cè) 制作膿毒癥模型后，B組膈肌肌條收縮力較A組明顯下降，肌細(xì)胞凋亡率及p38MAPK蛋白表達(dá)明顯上升。但給予烏司他丁治療后，雖然C組膈肌肌條收縮力仍較A組下降，肌細(xì)胞凋亡率及p38MAPK蛋白表達(dá)上升。C組膈肌肌條收縮力、p38MAPK蛋白表達(dá)及肌細(xì)胞凋亡率均較B組有改善，3個(gè)方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 3組大鼠p38MAPK蛋白表達(dá)、膈肌肌細(xì)胞凋亡率及膈肌收縮力比較（±s，n＝10）

表1 3組大鼠p38MAPK蛋白表達(dá)、膈肌肌細(xì)胞凋亡率及膈肌收縮力比較（±s，n＝10）

＊：P＜0.01，與A組比較；＃：P＜0.01，與B組比較。

組別 膈肌肌細(xì)胞凋亡率（%）p38MAPK蛋白平均灰密度（×10-3）肌條收縮力（N／cm2）×10-3 1.71±1.38 10.22±3.94 1 035.46±34.32 B組 25.16±2.71＊ 157.24±19.16＊ 174.87±28.83＊C組 14.42±1.03＊＃ 93.27±12.20＊＃ 300.59±19.94＊＃A組

2.3 膈肌病理切片 圖1所示A組膈肌結(jié)構(gòu)基本正常；圖2為制作膿毒癥模型16h后膈肌組織，組織水腫明顯，并有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；圖3為烏司他丁治療后膈肌組織，組織水腫減輕，炎性細(xì)胞較前減少。

圖1 A組膈肌病理切片（HE，×400）

圖2 B組膈肌病理切片（HE，×400）

圖3 C組膈肌病理切片（HE，×400）

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時(shí)膈肌的收縮力明顯下降［4］。在本實(shí)驗(yàn)中同樣也觀察到，制作CLP模型后膈肌收縮力明顯下降，只有A組的20%左右。而膈肌作為主要的呼吸肌，其收縮力下降又是膿毒癥患者長(zhǎng)時(shí)間不能撤離呼吸機(jī)的主要原因之一［5］。因此，對(duì)膿毒癥膈肌損傷機(jī)制的研究對(duì)制定有效的防治措施、降低術(shù)后并發(fā)癥、死亡率、改善患者生存質(zhì)量及降低醫(yī)療成本，具有重要的意義。

MAPK信號(hào)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡等［6］。p38信號(hào)通路是MAPK家族的重要組成成員，被認(rèn)為屬于“應(yīng)激誘導(dǎo)”的MAPK。而p38MAPK促進(jìn)凋亡的機(jī)制可能為：內(nèi)毒素激活p38MAPK信號(hào)通路后，p38可進(jìn)一步使促凋亡激活轉(zhuǎn)錄因子-2磷酸化，核因子-κB從細(xì)胞液易位至細(xì)胞核，促使DNA斷裂，最終發(fā)生細(xì)胞的肥大和凋亡［7］。本研究觀察到隨著p38MAPK蛋白表達(dá)增加，膈肌肌細(xì)胞凋亡率也明顯增加。而膈肌中凋亡細(xì)胞數(shù)目的增加，有收縮功能的細(xì)胞百分比勢(shì)必下降，那么也必然會(huì)對(duì)收縮力產(chǎn)生影響。抑制p38MAPK信號(hào)通路對(duì)于改善膿毒癥膈肌損傷具有重要意義［8］。

烏司他丁是在人尿液中發(fā)現(xiàn)的尿胰蛋白酶抑制劑，能廣譜、高效移植多種蛋白酶、脂水解酶、糖水解酶和不良刺激引起的炎性因子的釋放［9］，已廣泛應(yīng)用于急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭、改善器官缺血再灌注［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，制作膿毒癥模型后給予烏司他丁治療能夠明顯減少p38MAPK蛋白表達(dá)。并且在前期研究中作者發(fā)現(xiàn)烏司他丁能夠明顯減少膿毒癥時(shí)膈肌內(nèi)氧自由基釋放，降低SOD消耗。而氧自由基能夠作為第二信號(hào)增加p38MAPK蛋白表達(dá)，促進(jìn)p38MAPK磷酸化［11］。因此，烏司他丁可能是通過(guò)減少氧自由基釋放、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)抑制p38MAPK信號(hào)通路。

綜上所述，烏司他丁能夠有效抑制p38MAPK信號(hào)通路，減少膈肌肌細(xì)胞凋亡率，減輕膿毒癥膈肌損傷程度。因此，烏司他丁對(duì)于防治膿毒癥并發(fā)癥，降低死亡率，改善患者生活質(zhì)量有重要意義。

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