陳章榮，吳新華△，羅開良，何 泉，楊 瑛，向玉鸞，王小平

（1.大理學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，云南大理671000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 400016）

心肌梗死后膠原含量增多和成分的改變等膠原重塑參與了心衰的發(fā)生發(fā)展，防治病理性膠原重塑成為研究熱點(diǎn)。心肌間質(zhì)膠原重塑過程受基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）控制。在MMPs的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中，核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號(hào)通路的激活起重要作用，抑制NF-κB活化有可能改善間質(zhì)膠原重塑［1-2］。二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）是一種 NF-κB抑制劑，其能有效地抑制 NF-κB激活［3］。Kumar等［4］用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：PDTC通過抑制NF-κB活性，減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積，改善了心肌重塑。因此，PDTC有可能通過抑制NF-κB活性而改善心肌梗死后間質(zhì)膠原重塑，本研究將對(duì)此進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立及給藥方法 動(dòng)物模型制作參照文獻(xiàn)［5］的方法，以3.5%水合氯醛腹腔內(nèi)注射（10mL／kg）麻醉，氣管插管，經(jīng)胸骨左緣第2～4肋開胸，以左冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志，在左心耳下方2mm處進(jìn)針，6／0號(hào)絲線結(jié)扎左前降支，制作心肌梗死模型。心電圖觀察兩個(gè)以上肢體導(dǎo)聯(lián)上出現(xiàn)ST段上抬大于或等于0.2mV并伴有對(duì)應(yīng)導(dǎo)聯(lián)變化，同時(shí)肉眼觀結(jié)扎區(qū)域變白為造模成功。選擇造模成功、術(shù)后24h仍存活的大鼠，分為心肌梗死對(duì)照（MI）組和PDTC干預(yù)（PD）組。另設(shè)假手術(shù)（SH）組，在相同冠狀動(dòng)脈部位只穿線不結(jié)扎。每組動(dòng)物均為6只，如死亡則補(bǔ)充。PD組手術(shù)后24h給予PDTC（Calbiochem公司，美國(guó)）80mg·kg-1·d-1腹腔內(nèi)注射［6］，連續(xù)28d；MI組及SH組給生理鹽水對(duì)照。

1.2 超聲心動(dòng)圖 術(shù)后28d大鼠在處死前均行超聲心動(dòng)圖（HP／SONOS 5500多普勒超聲儀，探頭頻率4～10MHz），測(cè)定左室舒張末徑（LVEDD）、左室舒張末容積（LVEDV）、左室短軸縮短率（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）。

1.3 標(biāo)本留取、梗死面積計(jì)算、心肌膠原染色及定量分析 處死動(dòng)物，分離左心室，然后沿左心室長(zhǎng)軸分為3份，心底部及心尖部用液氮速凍后置-70℃保存用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及蛋白免疫印跡法檢測(cè)。中間部分切成3mm的薄片，行苦味酸天狼猩紅染色。普通光鏡下梗死區(qū)疤痕組織染成紅色為主，非梗死區(qū)染成黃色為主。佳能A530攝影后用Image Pro Plus 4.5軟件行圖像分析，計(jì)算梗死面積［7］。計(jì)算公式：梗死面積＝（疤痕內(nèi)弧長(zhǎng)＋疤痕外弧長(zhǎng)）／（外周長(zhǎng)＋內(nèi)周長(zhǎng)）×100%。取天狼猩紅染色切片在普通顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野采集非梗死區(qū)圖像，用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件測(cè)定紅色膠原所占組織學(xué)面積百分比，取平均值得到總膠原含量。用相同方法在偏振光顯微鏡下采集非梗死區(qū)圖像，測(cè)定紅色和橙黃色的Ⅰ型膠原、綠色的Ⅲ型膠原得到Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，計(jì)算Ⅰ／Ⅲ型膠原比值。

1.4 半定量RT-PCR檢測(cè)NF-κB及MMP-2表達(dá)水平 TRIzol法提取大鼠心肌組織總RNA。引物由上海博尚生物公司合成，各引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)體系為50μL，按試劑盒（日本Toyobo公司）說明進(jìn)行操作。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá) 取大鼠心肌組織，按RIPA試劑說明提取心肌總蛋白，BCA-100測(cè)定蛋白含量。取40μg蛋白經(jīng)10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶封閉1h后分別與兔抗鼠NF-κB、MMP-2、β-actin抗體（Santa Cruz公司產(chǎn)品，以 TBS稀釋，濃度分別為1∶750、1∶500、1∶500）室溫孵育2h；洗膜后與二抗（羊抗兔IgG）室溫孵育1h后化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、掃描分析。

表1 NF-κB、MMP-2和β-actin的RT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 超聲心動(dòng)圖 與SH組相比，MI組和PD組的LVEDD、LVEDV顯著增加，F(xiàn)S和EF顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與 MI組相比，MI組和PD組的LVEDD、LVEDV顯著降低，F(xiàn)S和EF顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

2.2 非梗死區(qū)膠原含量 心肌梗死面積在MI組及PD組無顯著性差異。與SH組比較，MI組和PD組總膠原、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原Ⅰ／Ⅲ比值顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與MI組相比，PD組的總膠原、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原Ⅰ／Ⅲ比值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表3和圖1。

2.3 NF-κB及 MMP-2mRNA水平表達(dá) 與SH組相比，MI組和PD組NF-κB、MMP-2的mRNA表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與 MI組相比，PD組的mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果見表4和圖2。

2.4 NF-κB及MMP-2蛋白質(zhì)水平表達(dá) MI組和PD組NF-κB、IL-1β的蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)于SH組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），PD組與 MI組相比，其蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果表5和圖3。

A：MI組；B：PD組；C：SH 組。

表2 各組超聲心動(dòng)圖相關(guān)指標(biāo)比較

表3 各組膠原含量比較

圖2 大鼠心肌NF-κB、MMP-2的RT-PCR結(jié)果

圖3 大鼠心肌NF-κB、MMP-2的蛋白質(zhì)表達(dá)

表4 NF-κB、MMP-2的 mRNA表達(dá)量

表5 NF-κB、MMP-2蛋白表達(dá)量

3 討 論

本研究中超聲心動(dòng)圖結(jié)果表明MI組和PD組的LVEDD和LVEDV較SH組增加，F(xiàn)S和EF降低；說明心肌梗死后大鼠心功能指標(biāo)惡化，大鼠心功能惡化可能與膠原重塑有關(guān)。心肌梗死后心肌間質(zhì)重塑主要膠原沉積，膠原沉積是心肌重塑的重要內(nèi)容，減少膠原沉積可改善心功能［8］。膠原重塑表現(xiàn)為總膠原、Ⅰ型膠原含量的增多和Ⅰ／Ⅲ型膠原比值增加。本研究通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制作大鼠心肌梗死模型，采用天狼猩紅染色觀察心肌非梗死區(qū)總膠原、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的變化。結(jié)果顯示MI組非梗死區(qū)總膠原和Ⅰ／Ⅲ型膠原比值增多較SH組多，說明心肌梗死后發(fā)生膠原重塑。Ⅰ型膠原含量的增多含量增多增加了心肌僵硬度，參與心衰發(fā)展。

MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的最主要蛋白水解系統(tǒng)，與心肌間質(zhì)膠原重塑有密切關(guān)系［9-10］。研究表明 MMPs在心肌梗死發(fā)生后即開始激活，并且重塑期間，MMP-2活性和表達(dá)均顯著增高［11］。陳昭喆等［12］研究也表明，心肌梗死后MMP-2表達(dá)增加，并與膠原重塑密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中在MI組和PD組MMP-2增加，同樣證實(shí)了在心肌重塑過程中存在表達(dá)MMPs增高。在MMPs的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中，NF-κB信號(hào)通路的激活起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)MI組大鼠的NF-κBp65的表達(dá)在心肌梗死后4周就已有增加，最近的研究也證明了心肌梗死后存在 NF-κB的激活［13］。Xie等［14］研究表明激活的 NF-κB 能直接刺激MMP-2表達(dá)。本研究中MI組MMP-2表達(dá)增加與NF-κBp65變化一致，再次說明NF-κBp65調(diào)節(jié)MMP-2表達(dá)。

既然 心 肌梗死后存在 NF-κB激 活，NF-κB通 過 促 進(jìn)MMPs表達(dá)引起膠原重塑是心肌間質(zhì)重塑的一個(gè)重要機(jī)制，那么應(yīng)用NF-κB抑制劑有可能通過此途徑改善膠原重塑，改善心功能。為此，本研究應(yīng)用NF-κB的特異性抑制劑PDTC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示PDTC干預(yù)后心肌梗死大鼠的總膠原、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原較MI組下降，LVEDD和LVEDV較MI組降低，F(xiàn)S和EF增加，說明PDTC改善了大鼠心肌梗死后間質(zhì)重塑，改善了心功能。Kumar等［4］用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：PDTC通過抑制NF-κB活性，減輕細(xì)胞外基質(zhì)沉積，改善了心肌重塑。PDTC抑制NF-κB機(jī)制為：PDTC能特異性抑制NF-κB亞單位表達(dá)或抑制IκB的降解，減少NF-κB的核轉(zhuǎn)為有關(guān)［15］。本研究中應(yīng)用PDTC后NF-κB表達(dá)降低，且其下游MMP-2表達(dá)相應(yīng)下降，因此推測(cè)PDTC改善大鼠心肌梗死后間質(zhì)膠原重塑可能與PDTC抑制NF-κB活性，下調(diào)MMPs的表達(dá)的表達(dá)有關(guān)。劉曉黎等［16］應(yīng)用PDTC通過抑制NF-κB活性改善了大鼠的肺血管重塑，降低了肺動(dòng)脈壓。Cau等［1］研究表明，在中應(yīng)用PDTC通過抑制，下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)改善了腎性高血壓大鼠的血管重塑，改善了血管功能。

總之，本研究表明PDTC通過抑制 NF-κB激活，降低MMP-2表達(dá)，改善心肌梗死后間質(zhì)后重塑，改善心功能，PDTC治療心肌梗死可能成為一個(gè)新的研究方向。但是，由于心肌梗死后心肌間質(zhì)重塑的機(jī)制較復(fù)雜，PDTC是否具有還有其他通路改善重塑，其安全如何等尚未評(píng)價(jià)，尚待進(jìn)一步研究。

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