閆靜波

（河北省邢臺市人民醫(yī)院病理科 054001）

硅肺是一種常見的職業(yè)病，其病變以硅結(jié)節(jié)形成和廣泛的肺纖維化為特征［1］。N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸（AcSDKP）是一種生理性造血系統(tǒng)生長抑制因子［2］。AcSDKP對多器官內(nèi)的多種類型細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)代謝和血管形成等方面有重要的調(diào)節(jié)作用。它能抑制心臟和腎臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞的增殖，減少膠原的沉積，對高血壓及心肌梗死后心臟和腎臟纖維化有一定的抑制作用［3-5］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）是2個亞單位p50和p65組成的異源二聚體，NF-κB參與許多前炎癥介質(zhì)分子轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子、炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)酶等大量釋放［6］。本研究觀察了AcSDKP對硅肺纖維化大鼠膠原合成和NF-κB p65的影響，借以探索NF-κB p65在硅肺纖維化發(fā)病機制中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180g，購于北京維通利華動物公司；AcSDKP購于瑞士Bachem AG公司；標(biāo)準(zhǔn)α石英粉塵（微粒直徑小于5μm）購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院；藥物釋放泵購于美國Alzet公司；VG試劑盒購于福州邁新生物工程公司；羥脯氨酸測試盒購于南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠NF-κB p65抗體購于武漢博士德生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型 選用非暴露式氣管插管灌注法制作大鼠硅肺模型，并給予AcSDKP治療。60只清潔級健康成年雄性Wistar大鼠分為3組，（1）對照組：每只支氣管內(nèi)灌注生理鹽水1.0mL，8周后處死；（2）硅肺模型組：每只大鼠支氣管內(nèi)灌注SiO250mg／mL，8周后處死；（3）治療組：每只大鼠支氣管內(nèi)灌注SiO250mg／mL，持續(xù)給予 AcSDKP 800μg·kg-1·d-1治療，8周后處死。各組大鼠分別于處理后相應(yīng)時間點處死。取右下葉肺組織4%多聚甲醛固定、脫水后常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，做HE染色、膠原VG染色和NF-κB p65免疫組化，取右中葉肺組織做膠原羥脯氨酸測定，取右上葉肺組織采用蛋白免疫印跡法檢測NF-κB p65蛋白表達(dá)。

1.2.2 HE染色 HE染色后觀察各組大鼠肺組織內(nèi)硅結(jié)節(jié)的形成與大小。用圖像分析儀系統(tǒng)測定每只大鼠每張切片隨機選擇5個200倍視野下，硅結(jié)節(jié)切面總面積占該視野總面積的百分比來半定量硅結(jié)節(jié)的大小。

1.2.3 膠原VG染色 觀察各組大鼠肺組織內(nèi)膠原纖維的形成及變化特點，進(jìn)行膠原半定量分析。染色嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。用圖像分析儀系統(tǒng)測定每只大鼠每張切片5個200倍視野下VG陽性染色的積分光密度值（integral optical density，IOD）來半定量肺內(nèi)膠原的含量。

1.2.4 膠原羥脯氨酸測定 測定組織羥脯氨酸的含量，可換算成膠原蛋白的含量，以反映實驗各組纖維化程度。采用對二甲氨基苯甲醛顯色法檢測肺組織羥脯氨酸含量，實驗步驟嚴(yán)格按照羥脯氨酸測試盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 NF-κB p65免疫組化染色 一抗為兔抗大鼠 NF-κB p65抗體，工作濃度1∶100，二抗為羊抗兔，采用SABC法DAB顯色。實驗嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。每張切片隨機選擇5個視野，在高倍光鏡下（×400）用圖像分析儀測定大鼠肺組織陽性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)。

1.2.6 NF-κB p65蛋白跡印法 提取大鼠肺組織蛋白，參照蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行蛋白含量測定，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移把凝膠內(nèi)的樣品蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，5%BSA常溫振蕩封閉1h，一抗體（NF-κB抗體），4℃過夜，二抗，室溫1h，加入堿性磷酸酶顯色劑顯色約20min，將NC膜用掃描儀對蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行灰度掃描，經(jīng)自動圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以對照組的平均光密度值（OD值）為1，其他各組與對照組相比取值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組間采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 （1）對照組雙肺粉紅，彈性良好，表面光滑。（2）硅肺模型組雙肺蒼白，表面可見散在灰白色結(jié)節(jié)，觸之略有砂粒感。（3）治療組雙肺顏色淺紅，彈性尚好，表面的灰白色的結(jié)節(jié)比硅肺模型組減少。

2.2 HE染色觀察 （1）對照組大鼠雙肺結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，間質(zhì)無明顯炎細(xì)胞浸潤。（2）硅肺模型組大鼠肺組織內(nèi)可見局灶性間質(zhì)性炎癥，以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞滲出浸潤為主。肺泡間隔水腫增寬，肺組織內(nèi)見纖維細(xì)胞性結(jié)節(jié)，并出現(xiàn)結(jié)節(jié)的融合。結(jié)果表明：大鼠硅肺模型制作成功。（3）治療組肺組織內(nèi)纖維細(xì)胞結(jié)節(jié)體積及數(shù)量均比硅肺模型組減少，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤減少。用硅結(jié)節(jié)切面面積占整個視野面積的百分比半定量分析硅結(jié)節(jié)的大小，結(jié)果顯示：治療組的硅結(jié)節(jié)面積比硅肺模型降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 膠原VG染色結(jié)果 VG染色膠原呈鮮紅色。（1）對照組膠原主要分布于肺泡間隔及血管壁，其他部位膠原少見。（2）硅肺模型組（圖1A）可見膠原纖維呈條紋狀分布于結(jié)節(jié)內(nèi)部及其周圍。（3）治療組（圖1B）膠原分布較硅肺模型組減少，膠原變細(xì)稀少。圖像分析儀結(jié)果顯示：硅肺模型組膠原含量比對照組增高，是對照組的5.29倍，治療組的膠原含量比對照組降低，是對照組的45.58%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.4 羥脯氨酸測定結(jié)果 羥脯氨酸測定結(jié)果顯示：硅肺模型組膠原含量比相應(yīng)對照組增高，是對照組的1.86倍。治療組的膠原含量比硅肺模型組降低，是硅肺模型組的60.27%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.5 免疫組化檢測NF-κB p65結(jié)果 NF-κB p65定位于胞核或胞質(zhì)，可表達(dá)于肺間質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，呈棕色顆粒。（1）對照組陽性細(xì)胞較少，主要表達(dá)于胞質(zhì)，胞核未見明顯表達(dá)，肺間質(zhì)細(xì)胞少有表達(dá)。（2）硅肺模型組（圖2A）陽性細(xì)胞較多，陽性顆粒的表達(dá)多位于胞核，陽性細(xì)胞主要分布硅結(jié)節(jié)內(nèi)部及周圍，肺間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)較多。（3）治療組（圖2B）陽性細(xì)胞數(shù)量比硅肺模型組減少，陽性顆粒的表達(dá)部分轉(zhuǎn)向胞漿，肺間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)減弱。圖像分析儀結(jié)果顯示：硅肺模型組NF-κB p65陽性率比對照組升高，是對照組的2.36倍，治療組的NF-κB P65陽性率比硅肺模型組降低，是硅肺模型組的64.55%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 AcSDKP對硅肺大鼠硅結(jié)節(jié)面積及膠原含量表達(dá)的影響（±s，n＝10）

表1 AcSDKP對硅肺大鼠硅結(jié)節(jié)面積及膠原含量表達(dá)的影響（±s，n＝10）

▽：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與硅肺模型組比較。

組別 硅結(jié)節(jié)面積（HE染色）膠原的IOD（VG染色）羥脯氨酸含量（μg／mg）對照組 0 1 039±291 0.821±0.049硅肺模型組 41.19±8.09▽ 5 496±835▽ 1.528±0.116▽治療組 25.18±5.66＃ 2 505±539＃ 0.921±0.100＃

表2 AcSDKP對硅肺大鼠NF-κB p65表達(dá)的影響（±s，n＝10）

表2 AcSDKP對硅肺大鼠NF-κB p65表達(dá)的影響（±s，n＝10）

▽：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與硅肺模型組比較。

組別 NF-κB陽性率（免疫組化法）NF-κB OD（免疫印跡法）9.00±4.69 1硅肺模型組 21.24±4.92▽ 2.97▽治療組 13.71±3.92＃ 1.43對照組＃

圖1 AcSDKP對硅肺纖維化大鼠肺內(nèi)膠原纖維形成的影響 （VG染色×200）

圖2 AcSDKP對硅肺纖維化大鼠肺內(nèi)NF-κB p65表達(dá)的影響 （免疫組化×400）

2.6 免疫印跡法檢測NF-κB p65表達(dá)結(jié)果 硅肺模型組NF-κB p65蛋白表達(dá)比對照組升高，是對照組的2.97倍，治療組的NF-κB p65蛋白表達(dá)比硅肺模型組降低，是硅肺模型組的48.15%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討 論

硅肺是由于長期吸入大量游離二氧化硅（SiO2）粉塵沉積于肺部引起的一種常見職業(yè)病，以硅結(jié)節(jié)的形成和廣泛的肺纖維化為特征。硅結(jié)節(jié)形成的初始階段是由吞噬硅塵的巨噬細(xì)胞聚集組成，繼而成纖維細(xì)胞增生，結(jié)節(jié)內(nèi)的膠原不斷沉積，使之發(fā)生纖維化，形成纖維性硅結(jié)節(jié)，同時肺內(nèi)還有不同程度的彌漫性間質(zhì)纖維化［7］。

AcSDKP是一種生理性造血系統(tǒng)的生長抑制因子，對大鼠腎臟、心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞及人腎小球系膜細(xì)胞的增殖與膠原的合成沉積有抑制作用［8］。AcSDKP能夠減輕糖尿病小鼠腎小球硬化程度，改善小鼠腎臟功能［9］。在大鼠心肌梗死心衰模型中，AcSDKP能夠減輕炎癥，拮抗心臟間質(zhì)纖維化［10］。在兩腎一夾高血壓大鼠和血管緊張素Ⅱ型高血壓大鼠模型中，AcSDKP同樣能減輕心、腎纖維化的程度［11-12］。

在本研究中，通過硅結(jié)節(jié)面積測定、大染色測膠原OD值及羥脯氨酸測定膠原含量，均發(fā)現(xiàn)治療組肺組織硅結(jié)節(jié)面積及膠原含量比硅肺模型組減少，證明AcSDK能夠抑制大鼠硅肺纖維化。

近年來，NF-κB與器官纖維化之間的關(guān)系日益受到人們的關(guān)注。NF-κB是一類能與多種基因啟動子或增強子部位κB位點發(fā)生特異性結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在各種因子的相互影響和相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)核因子而起中心調(diào)控作用，參與免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化、生長調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［13］。通常NF-κB是2個亞單位p50和p65組成的異源二聚體，細(xì)胞處于未激活的靜息狀態(tài)時，p65亞單位與B抑制蛋白（I-κB）單體結(jié)合，覆蓋p50蛋白的核定位信號，以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)機體受到外界因素刺激時，NF-κB被誘導(dǎo)活化，從胞質(zhì)轉(zhuǎn)向胞核，與DNA鏈上特異部位結(jié)合，誘導(dǎo)和增強其基因表達(dá)，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、氧自由基、一氧化氮及前列腺素等炎性介質(zhì)大量產(chǎn)生，引發(fā)炎癥免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)器官纖維化［14-15］。

在本研究中，通過免疫組化和免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)硅肺模型組NF-κB p65表達(dá)比對照組明顯增高，并且對照組NF-κB p65陽性顆粒主要為胞漿表達(dá)，而硅肺模型組中陽性的部位多在胞核，以肺間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞陽性表達(dá)居多。這與Baroni等［16］在硅肺大鼠肺組織中觀察到的NF-κB表達(dá)情況基本一致。反映了硅肺大鼠纖維化形成發(fā)展過程中NF-κB被激活，由胞質(zhì)移向胞核，表達(dá)增強，促進(jìn)細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子、炎癥因子、氧化應(yīng)激相關(guān)酶大量釋放，他們可引起中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的活化，增強中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞趨化功能，刺激成纖維細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致肺纖維化。在本研究中，治療組肺間質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的NF-κB p65表達(dá)比硅肺模型組降低，并且NF-κB p65的陽性顆粒的表達(dá)部分位于胞漿，提示在治療組中，AcSDKP可能會通過增加I-κB的穩(wěn)定性來抑制NF-κB p65的活性，進(jìn)而影響著肺泡炎與硅肺纖維化的進(jìn)展。

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