劉夫國(guó)，金邦荃*，牛麗影，劉春泉，宋江峰，李大婧

(1. 南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇 南京 210014；3. 國(guó)家農(nóng)業(yè)科技華東(江蘇)創(chuàng)新中心-農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

鮮食玉米脂氧合酶的酶學(xué)性質(zhì)

劉夫國(guó)1,2,3，金邦荃1,*，牛麗影2,3，劉春泉2,3，宋江峰2,3，李大婧2,3

(1. 南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇 南京 210014；3. 國(guó)家農(nóng)業(yè)科技華東(江蘇)創(chuàng)新中心-農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

本實(shí)驗(yàn)研究鮮食玉米脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)的酶學(xué)性質(zhì)。以新鮮甜玉米、糯玉米籽粒及其胚為試材，采用紫外分光光度法，以亞油酸為底物，探討了酶提取部位、酶促反應(yīng)溫度、pH值及底物濃度對(duì)LOX活性的影響。結(jié)果表明，鮮食玉米胚中LOX活性顯著高于鮮食玉米籽粒，其最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為6.0，最適底物濃度為8.0mmol/L，提高溫度和延長(zhǎng)處理時(shí)間能有效地鈍化LOX。

鮮食玉米；脂氧合酶；活性；酶學(xué)性質(zhì)

近年來，鮮食甜玉米和糯玉米因其豐富的營(yíng)養(yǎng)及鮮、脆、嫩等良好的感官品質(zhì)越來越受消費(fèi)者青睞。鮮食玉米采收后，其感官品質(zhì)常常發(fā)生劣變，研究發(fā)現(xiàn)，LOX對(duì)鮮食玉米貯藏過程中不良風(fēng)味的形成具有不可忽視的作用[1-2]。LOX廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，專一催化含有cis,cis-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸及其相應(yīng)酯的加氧反應(yīng)，生成具有共軛雙鍵的多元不飽和酸的氫過氧化物[3]。在果蔬中，該氧化產(chǎn)物可繼續(xù)降解為醛類、酮類、醇類、呋喃類等揮發(fā)性化合物從而引起果蔬品質(zhì)劣變。因此，常將LOX作為果蔬加工中貯藏穩(wěn)定性的重要指標(biāo)之一。

為了發(fā)揮酶催化反應(yīng)的高效率，全面了解酶作用機(jī)制，諸多學(xué)者對(duì)豆類、水稻、大麥、花生、黃瓜、番茄、蘋果和桃等植物中LOX進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究。LOX活性受來源、反應(yīng)體系pH值及溫度、底物濃度等諸多因素的影響[4]。本研究擬對(duì)鮮食玉米LOX的酶學(xué)性質(zhì)作初步探討，以期為鮮食玉米貯藏加工過程中酶活控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮食甜玉米(品種為“晶甜3號(hào)”)、糯玉米(品種為“京甜紫花糯2號(hào)”)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；亞油酸 美國(guó)Sigma公司；氫氧化鈉、吐溫-20、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼酸、硼砂均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；H-2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；恒溫水浴鍋 江蘇金壇市大地自動(dòng)化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 LOX活性檢測(cè)

參照Axelrod等[5]的方法，略作調(diào)整，手工剝離完整的新鮮甜玉米、糯玉米籽粒，并分離得到胚組織，分別稱取籽粒及其胚5.0g左右放入研缽，加入液氮，迅速研碎，加入15mL經(jīng)4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH7.0)，冰浴勻漿，多次浸提后定容至25mL，取5mL 10000×g(4℃)離心30min，上清液用于LOX活性的測(cè)定。

采用3.25mL反應(yīng)體系，其中磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH 6.0)2.8mL，亞油酸底物溶液0.25mL(取70mg(70μL)亞油酸加入同體積的吐溫-20，4mL無氧水，搖勻加入足量的0.5mol/L NaOH得到清亮的溶液，以0.05mol/L pH7.0磷酸緩沖液定容到25mL)，酶液0.2mL，在25℃條件下反應(yīng)，于波長(zhǎng)234nm測(cè)定其吸光度。加酶液15s開始計(jì)時(shí)，每10s讀數(shù)一次，記錄1min內(nèi)吸光度的變化。以pH7.0的磷酸緩沖液代替酶液做空白對(duì)照。重復(fù)3次。酶活力單位(U)定義為每克樣品每分鐘吸光度的變化值。

酶活力及相對(duì)酶活力按式(1)、(2)計(jì)算。

式中：ΔA0為未經(jīng)熱處理的樣品的吸光度變化值；ΔAt為熱處理t min后的樣品的吸光度變化值。

1.3.2 反應(yīng)溫度實(shí)驗(yàn)

將裝有磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH6.0)和亞油酸底物(8.0mmol/L)的試管置于一定溫度(40～65℃)的水浴鍋中加熱一段時(shí)間至恒溫，然后依次加入鮮食玉米胚LOX提取液進(jìn)行活性測(cè)定。

1.3.3 pH值實(shí)驗(yàn)

在不同pH值條件[6](pH4.0～5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH 6.0～7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH 8.0～9.0硼砂-硼酸緩沖液，濃度均為0.05mol/L)下，在25℃條件下測(cè)定鮮食玉米胚中LOX提取液的活性。

1.3.4 底物濃度實(shí)驗(yàn)

在25℃、pH6.0的條件下，將鮮食玉米胚中LOX酶液與不同濃度(2.5～10.0mmol/L)亞油酸底物反應(yīng)，測(cè)定其活性。

1.3.5 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將鮮食玉米胚LOX提取液置于試管中，在50、55、60、65、70℃水中處理一定時(shí)間(0～24min)后，冰浴冷卻，在25℃、pH 6.0的條件下測(cè)定LOX活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤；用Origin 8.5軟件進(jìn)行制圖。

式中：A(30s)為反應(yīng)30s的吸光度；A(15s)為反應(yīng)15s時(shí)的吸光度；m為參與反應(yīng)的樣品鮮質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜玉米、糯玉米不同部位LOX活性比較

為了簡(jiǎn)便快速地考察不同條件下LOX的活性，常選取LOX緩沖鹽提取液作為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)采用磷酸緩沖液分別提取甜玉米籽粒與胚、糯玉米籽粒與胚中的LOX，在25℃、pH6.0的條件下測(cè)定其活性，結(jié)果見圖1。

圖1 鮮食玉米不同部位LOX活性Fig.1 LOX activity in different parts of fresh corn

由圖1可知，鮮食玉米胚中LOX活性顯著高于籽粒，甜玉米胚中LOX活性為籽粒的2.2倍，糯玉米胚中LOX活性為籽粒的9.5倍。不同品種鮮食玉米不同部位的LOX活性差異顯著(P＜0.05)，糯玉米胚中LOX活性為甜玉米胚的1.3倍，而糯玉米籽粒LOX活性僅為甜玉米籽粒的30%，結(jié)果表明，不同品種鮮食玉米中LOX的空間表達(dá)特性存在較大差異。亞細(xì)胞定位研究證實(shí)，植物種子LOX主要存在于脂體、液泡、微粒體、葉綠體、質(zhì)膜及胞漿[7]中，由于鮮食玉米中胚部分含有大量脂體，因此LOX活性相對(duì)較高。

2.2 反應(yīng)溫度對(duì)鮮食玉米胚中LOX活性的影響

圖2 不同反應(yīng)溫度下鮮食玉米胚中LOX活性Fig.2 LOX activity in fresh corn at different temperatures

由圖2可知，兩種鮮食玉米胚中LOX活性隨反應(yīng)溫度的變化趨勢(shì)相似，在40～55℃范圍內(nèi)，鮮食玉米LOX活性隨溫度的升高而升高，在55℃時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)溫度高于55℃時(shí)，兩種鮮食玉米胚中LOX活性隨著溫度的升高而降低。這主要是由于一方面升高溫度加速了酶促反應(yīng)的進(jìn)行，另一方面升高溫度加速了酶蛋白變性[8]。Theerakulkait等[9]研究發(fā)現(xiàn)甜玉米LOX的最適反應(yīng)溫度在50℃左右，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的55℃與之略有差異，可能與反應(yīng)體系和加熱方法不同有關(guān)。大量研究證實(shí)，多數(shù)植物L(fēng)OX最適反應(yīng)溫度在30～45℃之間，如青豌豆最適反應(yīng)溫度為30℃[10]；香蕉葉最適反應(yīng)溫度為40℃[11]，牡丹花最適反應(yīng)溫度為45℃[12]。

2.3 pH值對(duì)鮮食玉米胚中LOX活性的影響

圖3 不同pH值條件下鮮食玉米胚中LOX活性Fig.3 LOX activity in fresh corn in buffers with different pH levels

由圖3可知，當(dāng)pH值低于5.0時(shí)或高于9.0時(shí)，幾乎檢測(cè)不到LOX的活性；在酸性pH值范圍內(nèi)，隨著pH值升高，甜玉米和糯玉米胚中LOX的活性均先升高后降低，在pH6.0時(shí)均達(dá)到最大值，此時(shí)糯玉米胚中LOX活性為甜玉米的1.33倍；在堿性pH值范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，糯玉米胚中LOX活性先升高后降低，而甜玉米胚中LOX活性一直降低。甜玉米胚中LOX的最適pH值在6.0左右，而糯玉米胚中LOX有兩個(gè)pH值活性峰，其中以pH6.0時(shí)活性較高，在pH8.0時(shí)的相對(duì)活性為pH6.0時(shí)的83.7%。類似糯玉米胚中LOX這樣有兩個(gè)pH值活性峰的情況在其他植物中也有報(bào)道。如Mahanta等[13]研究發(fā)現(xiàn)毛尖茶葉中LOX在pH7.5和pH9.0時(shí)有活性峰，李強(qiáng)等[14]證實(shí)黃瓜果實(shí)中LOX在pH7.0和pH9.0時(shí)有活性峰。

研究表明，LOX是一個(gè)多基因家族，存在多種同工酶，不同LOX的最適pH值存在差異，如目前已知的大豆LOX同工酶至少有6種，其中3種LOX-1、LOX-2、LOX-3為貯藏蛋白并主要存在于大豆種子中，LOX-1、LOX-2、LOX-3的最適反應(yīng)pH值分別為9.0、6.5、7.0。本實(shí)驗(yàn)中，甜玉米胚中LOX的最適pH值為6.0，其LOX類型可能與大豆LOX-2接近，糯玉米籽粒胚中LOX具有兩個(gè)較適宜反應(yīng)的pH值，可能其LOX是由兩種同工酶組成的，至于這兩個(gè)活性峰所代表的是否為不同同工酶的最適pH值，還有待進(jìn)一步分離各組分后再作研究。

2.4 底物濃度對(duì)鮮食玉米胚中LOX活性的影響

由圖4可知，在底物濃度2.5～8.0mmol/L時(shí)，LOX活性隨底物濃度的增加而升高；但當(dāng)所加底物濃度超過8.0mmol/L后，隨著底物濃度的增加，甜玉米和糯玉米胚中LOX活性均上升不顯著(P＞0.05)。這可能是由于反應(yīng)體系中底物亞油酸濃度過高時(shí)，有一部分在空氣中自動(dòng)氧化為羥基過氧化物，當(dāng)羥基過氧化物達(dá)到一定濃度后，抑制了LOX的活性[15]。Romero等[16]研究發(fā)現(xiàn)，甜玉米LOX的最適底物濃度為2.0mmol/L，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之存在差距，這可能與玉米品種、酶提取方法及測(cè)定體系的不同有關(guān)。

圖4 不同底物濃度條件下鮮食玉米胚LOX活性Fig.4 LOX activity in fresh corn in substrate with different concentrations

2.5 鮮食玉米胚中LOX的熱穩(wěn)定性

為研究不同溫度處理對(duì)LOX的鈍化效果，將LOX提取液在特定的溫度下保溫后測(cè)定相對(duì)酶活力。以處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖5、6。

圖5 甜玉米胚中LOX熱失活曲線Fig.5 Thermal inactivation curves of LOX in sweet corn

圖6 糯玉米胚中LOX熱失活曲線Fig.6 Thermal inactivation curves of LOX in sweet corn

由圖5～6可知，50℃處理甜玉米胚LOX時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，其活性呈現(xiàn)波狀變化，24min內(nèi)變化幅度在10%以內(nèi)，表明在低于最適反應(yīng)溫度時(shí)，短時(shí)間處理甜玉米胚LOX對(duì)其活性影響不大。50℃處理糯玉米胚LOX時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，LOX活性呈緩慢上升而后又降低的趨勢(shì)，處理20min后，其活性可增加20%，這表明，50℃處理對(duì)糯玉米胚LOX存在一定的激活作用。由以上可知，低于最適反應(yīng)溫度時(shí)處理鮮食玉米胚LOX，其自身溫度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加，反應(yīng)物分子動(dòng)能隨之增加，酶活性增加，低溫短時(shí)間內(nèi)(小于24min)處理鮮食玉米胚LOX不會(huì)出現(xiàn)熱失活現(xiàn)象。當(dāng)溫度為55℃時(shí)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，甜玉米胚LOX活性逐漸降低，24min時(shí)其活性降低了90%，糯玉米胚LOX活性在24min內(nèi)整體呈下降趨勢(shì)，在前12min LOX活性差異不顯著(P＞0.05)，后12min活性降低了20%。處于最適反應(yīng)溫度時(shí)，隨著處理時(shí)間的變化，甜玉米胚LOX對(duì)溫度的敏感性高于糯玉米。60、65℃鈍化鮮食玉米胚LOX時(shí)，甜玉米胚LOX的熱失活曲線包含初始快速失活和慢失活階段，糯玉米胚LOX失活速率變化較小，這可能由于不同品種鮮食玉米胚LOX同工酶組成不同，而不同的同工酶具有不同的活性形式，酶失活表現(xiàn)為各種形式的綜合作用造成的。在70℃處理鮮食玉米胚LOX時(shí)，甜玉米和糯玉米胚LOX活性呈線性下降，甜玉米胚LOX在處理3min時(shí)，糯玉米胚LOX在處理4min時(shí)，活性均消失，出現(xiàn)這種變化的原因主要是高溫加速酶蛋白變性，而這種變性隨時(shí)間累積而加強(qiáng)。

3 結(jié) 論

鮮食玉米不同部位對(duì)LOX活性影響差異顯著，胚中LOX活性高于籽粒；酶促反應(yīng)的最適溫度為55℃；甜玉米胚中LOX最適pH值為6.0，糯玉米胚中LOX活性峰分別為pH6.0和pH8.0，以pH6.0時(shí)活性較高；當(dāng)亞油酸濃度為8mmol/L時(shí)，LOX被底物飽和，酶反應(yīng)速度最大；甜玉米胚中LOX耐熱性高于糯玉米，提高溫度和延長(zhǎng)處理時(shí)間能有效地鈍化LOX活性。

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Lipoxygenase Activity of Fresh Corn

LIU Fu-guo1,2,3，JIN Bang-quan1,*，NIU Li-ying2,3，LIU Chun-quan2,3，SONG Jiang-feng2,3，LI Da-jing2,3
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. Institute of Farm Product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China；3. Engineering Research Center for Agricultural Products Processing, National Agricultural Science and Technology Innovation Center in East China, Nanjing 210014, China)

The factors for fresh corn lipoxygenase (LOX) were investigated by using spectrophotometric assay. Using linoleic acid as the substrate and fresh sweet corn and waxy corn as samples, LOX activity was determined in reaction system with different extraction positions, enzymatic reaction pH levels and reaction temperatures and substrate concentrations. The results indicated that LOX activity in the germ was significantly higher than that in the whole kernel, and the enzyme had optimal temperature of 55 ℃, optimal pH of 6.0, and optimal substrate concentration of 8.0 mmol/L. The thermal stability of LOX was significantly inhibited by increasing temperature and prolonging heat treatment.

fresh corn；lipoxygenase；activity；characterization

TS201.2

A

1002-6630(2013)03-0198-04

2012-03-19

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(CXLX11_0894)；南京師范大學(xué)研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目

劉夫國(guó)(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称菲焚|(zhì)學(xué)。E-mail：liufuguo@sina.cn

*通信作者：金邦荃(1956—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槿馄穼W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：jinbangquan@njnu.edu.cn