雷 艷，董兆君 (第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所，重慶400038)

線粒體是細胞的能量代謝中心，參與氧化應(yīng)激、基因表達和細胞凋亡等多種重要過程的調(diào)控。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)是線粒體與細胞質(zhì)間進行物質(zhì)和信息交換的重要通道［1］，是影響線粒體穩(wěn)定性和細胞功能的關(guān)鍵因素之一。氧化應(yīng)激、能量耗竭、細胞內(nèi)酸中毒等多種因素可誘發(fā)mPTP開放，mPTP開放在組織細胞的缺血性、氧化性損害中起著重要作用［2］。通過前期研究我們發(fā)現(xiàn)，線粒體mPTP關(guān)閉劑環(huán)孢素A(cyclosporin A，CsA)對嚴重創(chuàng)傷失血性休克有較好的治療作用，但CsA是如何發(fā)揮抗休克作用的，尚不清楚。本實驗采用大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型，觀察不同劑量CsA對休克引起缺血缺氧狀態(tài)下動物血氣指標(biāo)的影響，以進一步了解CsA發(fā)揮抗休克作用的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SD大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量(203±20)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實驗動物中心提供。隨機分為6組，每組8只動物，分別為正常對照組、休克對照組(Shock組)、乳酸林格氏液復(fù)蘇組(LR組)、乳酸林格氏液+CsA 1 mg/kg組(CsA 1組)、乳酸林格氏液+CsA 5 mg/kg組(CsA 5組)、乳酸林格氏液+CsA 10 mg/kg組(CsA 10組)。

1.2 實驗方法

動物實驗前12 h禁食，自由飲水，實驗當(dāng)日用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，行右側(cè)股動脈、股靜脈插管。股動脈插管經(jīng)三通管連接水銀血壓計和玻璃注射器，用以觀察血壓、放血和取血測量血氣指標(biāo)，股靜脈插管用以給藥復(fù)蘇，經(jīng)插管注射肝素鈉生理鹽水(500 U/kg)抗凝。將大鼠單側(cè)股骨折斷，并經(jīng)股動脈插管放血，使血壓維持在40 mmHg，持續(xù)3 h，以此方法建立創(chuàng)傷失血性休克模型，并按照分組予以不同處理。正常對照組不進行骨折和放血處理，僅插管檢測血氣指標(biāo);Shock組在創(chuàng)傷失血性休克模型完成后不復(fù)蘇;LR組給予2倍失血量的乳酸林格液(LR)進行復(fù)蘇;LR+CsA 1、5、10 mg/kg組分別將1、5、10 mg/kg的CsA加入2倍失血量的LR中輸注，復(fù)蘇均用輸液泵輸注。各組分別于休克前、休克末(創(chuàng)傷失血性休克3 h)、復(fù)蘇后1 h、復(fù)蘇后2 h取血，檢測pH、HCO3-、堿剩余(base excess，BE)、乳酸等指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示，組間多重比較采用Tukey檢驗，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 CsA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠pH值的影響

休克末時，各休克處理組的pH值均明顯低于正常對照組(P＜0.05)。液體復(fù)蘇后各組pH值逐漸回升，在復(fù)蘇2 h時，LR組和CsA各劑量組的pH值與正常組無顯著差異，CsA1.5 mg/kg組明顯高于 Shock組(P＜0.05)，見表1。

2.2 CsA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠HCO3-的影響

休克后HCO3-值明顯降低，各休克處理組均低于正常組(P＜0.05)。不同劑量CsA輸注后HCO3-有不同程度升高，在復(fù)蘇2 h時，CsA 1 mg/kg組和CsA 5 mg/kg組的HCO3-值明顯高于Shock組(P＜0.05)，且 CsA 5 mg/kg組明顯高于 LR組(P ＜0.05)，見表2。

2.3 CsA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠BE的影響

休克末時，各休克處理組的BE值均明顯低于正常組(P＜0.05)。復(fù)蘇后BE指標(biāo)逐漸回升，在復(fù)蘇2 h時，CsA各劑量組的 BE值均明顯高于 Shock組(P＜0.05)，且 CsA 5 mg/kg組明顯高于LR組(P＜0.05)，見表3。

2.4 CsA對創(chuàng)傷失血性休克大鼠乳酸的影響

休克后乳酸值顯著升高(P＜0.05)。經(jīng)液體復(fù)蘇后，乳酸值有所下降。在復(fù)蘇2 h時，CsA各劑量組的乳酸值均明顯低于Shock組(P＜0.05)，且 CsA 5 mg/kg組明顯低于 LR組(P ＜0.05)，見表4。

表1 各處理組pH的變化情況(±s，n=8)

表1 各處理組pH的變化情況(±s，n=8)

*:與正常組比較，P ＜0.05;#:與 Shock組比較，P ＜0.05

2 h正常組分組 休克前 休克末 復(fù)蘇后1 h 復(fù)蘇后7.38 ±0.06 7.39 ±0.06 7.40 ±0.07 7.38 ±0.08 Shock 組 7.39 ±0.04 7.28 ±0.04* 7.27 ±0.04* 7.29 ±0.05 LR 組 7.36 ±0.03 7.23 ±0.06* 7.31 ±0.07 7.34 ±0.05 CsA 1 組 7.40 ±0.05 7.25 ±0.05* 7.37 ±0.03# 7.44 ±0.04#CsA 5 組 7.39 ±0.04 7.26 ±0.10* 7.33 ±0.08 7.39 ±0.08#CsA 10 組 7.41 ±0.03 7.21 ±0.09*7.33 ±0.08 7.38 ±0.08

表2 各處理組HCO3－的變化情況(±s，n=8，mmol/L)

表2 各處理組HCO3－的變化情況(±s，n=8，mmol/L)

*:與正常組比較，P＜0.05;#:與 Shock組比較，P ＜0.05;△:與 LR 組比較，P ＜0.05

2 h正常組 25.76 ±1.95 25.60 ±3.60 23.74 ±2.57 24.55 ±2.93分組 休克前 休克末 復(fù)蘇后1 h 復(fù)蘇后Shock 組 23.61 ±2.95 13.21 ±2.16* 11.84 ±2.93* 12.05 ±2.81*LR 組 23.20 ±1.91 14.51 ±1.27* 14.34 ±1.90* 15.46 ±1.44*CsA 1 組 22.39 ±2.28 12.21 ±1.70* 15.29 ±2.12* 17.83 ±2.79*#CsA 5 組 25.16 ±2.44 12.55 ±2.33* 19.55 ±3.16*#△ 19.41 ±3.33*#△CsA 10 組 24.75 ±2.14 10.31 ±2.41* 14.11 ±2.37* 15.84 ±1.55*

表3 各處理組BE的變化情況(±s，n=8，mmol/L)

表3 各處理組BE的變化情況(±s，n=8，mmol/L)

*:與正常組比較，P＜0.05;#:與 Shock組比較，P ＜0.05;△:與 LR 組比較，P ＜0.05

2 h正常組分組 休克前 休克末 復(fù)蘇后1 h 復(fù)蘇后-1.60 ±1.53 -0.33 ±2.34 0.95 ±1.98 1.91 ±1.58 Shock 組 -0.45 ±2.34 -13.60 ±2.39* -14.55 ±3.58* -14.06 ±3.70*LR 組 -1.05 ±2.01 -13.94 ±2.21* -12.33 ±2.59* -11.35 ±2.76*CsA 1 組 -2.29 ±1.61 -14.55 ±1.93* -10.43 ±2.74* -7.24 ±2.75*#CsA 5 組 0.59 ±2.84 -13.84 ±2.54* -8.41 ±3.69*# -6.29 ±3.05*#△CsA 10 組 0.06 ±1.71 -16.74 ±3.13* -12.06 ±3.19* -9.49 ±2.42*#

表4 各處理組乳酸的變化情況(±s，n=8，mmol/L)

表4 各處理組乳酸的變化情況(±s，n=8，mmol/L)

*:與正常組比較，P＜0.05;#:與 Shock組比較，P ＜0.05;△:與 LR 組比較，P ＜0.05

2 h正常組分組 休克前 休克末 復(fù)蘇后1 h 復(fù)蘇后1.26 ±0.30 1.75 ±0.46 2.33 ±0.51 2.14 ±0.57 Shock 組 1.40 ±0.40 8.70 ±0.93* 8.53 ±1.13* 8.18 ±1.11*LR 組 1.64 ±0.53 8.73 ±1.59* 8.39 ±1.21* 6.66 ±0.99*CsA 1 組 1.15 ±0.28 8.61 ±0.57* 6.88 ±0.52*#△ 6.01 ±1.44*#CsA 5 組 1.35 ±0.29 9.29 ±1.19* 5.95 ±1.14*#△ 4.48 ±0.93*#△CsA 10 組 0.98 ±0.17 8.89 ±1.28* 6.73 ±0.75*#△ 5.80 ±1.15*#

3 討論

創(chuàng)傷失血性休克是戰(zhàn)創(chuàng)傷最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率和死亡率都很高。液體復(fù)蘇是進行休克早期治療的重要措施。但由于嚴重創(chuàng)傷失血性休克的病因、病理復(fù)雜，單純通過液體輸入來補充血容量，難以達到理想的救治效果。因此，在嚴重創(chuàng)傷失血性休克情況下，如何提高液體復(fù)蘇的效果，是亟待深入研究和解決的難題。

線粒體是細胞能量代謝的中心，是細胞氧化磷酸化反應(yīng)產(chǎn)生ATP的重要場所，調(diào)控著細胞能量代謝和凋亡通路［3］。mPTP是位于線粒體內(nèi)、外膜之間的非特異性孔道，能夠調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，是線粒體進行氧化應(yīng)激、ATP合成及實現(xiàn)其生理功能的必要條件［4-5］。正常情況下，mPTP 處于間斷性開放狀態(tài)［6］，線粒體內(nèi)膜通透性小。當(dāng)mPTP大量開放時，線粒體外的Ca2+大量內(nèi)流，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)滲透壓升高，線粒體外膜損傷，膜電位下降，呼吸鏈解偶聯(lián)，細胞色素C等小分子蛋白釋放，最終誘導(dǎo)細胞凋亡或死亡［7-9］。因此，mPTP是細胞凋亡線粒體途徑的樞紐。

環(huán)孢素A是一種主要作用于T淋巴細胞的強效免疫抑制劑，廣泛應(yīng)用于器官移植后抗排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病的治療［10-11］。同時，CsA可能通過與mPTP的重要組成部分親環(huán)蛋白CyP-D結(jié)合，發(fā)揮強效的抑制mPTP開放的作用。國內(nèi)外研究報道，CsA可對組織缺血再灌注損傷發(fā)揮較好的保護作用。我們的前期實驗結(jié)果提示，mPTP開放可能參與了休克后血管低反應(yīng)性的發(fā)生，而mPTP關(guān)閉劑CsA對嚴重創(chuàng)傷失血性休克有較好的治療作用，但CsA是如何發(fā)揮抗休克作用的，目前尚不清楚。在本實驗中，休克后大鼠pH值下降、HCO3-明顯降低、BE負值增大、乳酸升高，這些血氣指標(biāo)變化均提示代謝性酸中毒的存在。經(jīng)過液體復(fù)蘇后，血氣指標(biāo)有所改善，單純應(yīng)用LR復(fù)蘇對血氣指標(biāo)的改善作用較弱，給予CsA復(fù)蘇的效果明顯優(yōu)于單純使用LR。通過CsA不同劑量組之間的比較，我們發(fā)現(xiàn)給予5 mg/kg CsA的治療效果優(yōu)于1 mg/kg和10 mg/kg，其原因可能是CsA與其他親環(huán)蛋白家族成員結(jié)合，產(chǎn)生不利后果［4］。這一結(jié)果提示在使用CsA進行休克治療時應(yīng)掌握好劑量，避免大量用藥時產(chǎn)生的全身毒副作用。

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