姜復(fù)齡，何 佳 (.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所脊柱外科，重慶40004;.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北武漢400030)

近年來(lái)，嗅鞘細(xì)胞(OECs)移植治療脊髓損傷有新的進(jìn)展。Stamegna等［1］在比較 OECs、SCs及新生大腦細(xì)胞移植治療脊髓脫髓鞘模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，電生理測(cè)得OECs和SCs組軸突的傳導(dǎo)速度和反應(yīng)頻率提高，說(shuō)明軸突重新髓鞘化。將人胚胎嗅球嗅鞘細(xì)胞移植對(duì)117例不同脊髓節(jié)段損傷的晚期患者進(jìn)行治療，都有不同程度的脊髓功能的恢復(fù)［2］。除單純OECs移植外，基因修飾后的OECs移植亦具有促進(jìn)神經(jīng)再生的功能，而且作用可能更大。除此之外，嗅鞘細(xì)胞與傳統(tǒng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族細(xì)胞基因的修飾［3］，與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因?qū)е碌挠郎?］，進(jìn)一步的提升了嗅鞘細(xì)胞在脊髓損傷治療方面的功能。本實(shí)驗(yàn)探討純化的大鼠嗅鞘細(xì)胞對(duì)損傷的脊髓的修復(fù)作用，評(píng)價(jià)其作為脊髓損傷治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，小鼠抗大鼠Thy1.1單克隆抗體、羊抗小鼠IgG(Sigma公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，多聚氨酸(poly-L-Lysine:Sigma公司)，阿糖胞苷(arabinoside cytosi Ara-c:Sigma公司)，牛垂體提取物(bovine pituitary extract BPE:Sigma公司)，F(xiàn)orskolin(Sigma公司)，DAB免疫組化試劑盒(北京中山公司)，GENMED冰凍切片神經(jīng)纖維銀染試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生Wistar大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供(許可號(hào):20051006)。

1.2 嗅鞘細(xì)胞的分離和純化

無(wú)菌環(huán)境下完整分離大鼠嗅球，剝除軟腦膜和血管膜(解剖顯微鏡下)，機(jī)械分離嗅球成3組1～2 mm織小塊。用0.2%胰酶37℃孵箱中消化30 min，濾網(wǎng)濾過(guò)組織殘?jiān)杖〖?xì)胞懸液，1 000r/min離心15 min，棄上清加入無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基清洗，最后用10%FBS完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。

采用改良Nash差速貼壁法和Ara-c化學(xué)抑制純化培養(yǎng)OECs。Ara-c終濃度為1×105mol/L，作用48 h，加入條件培養(yǎng)基(10%FBS+20 μmol/L forskolin+20 μg/L BPE+DMEM/F12)純化培養(yǎng)。細(xì)胞與小鼠抗大鼠Thy1.1單克隆抗體共同孵育30 min，沖洗后去除多余的抗體;細(xì)胞置于羊抗小鼠IgG包被的培養(yǎng)瓶中4℃下孵育1 h后細(xì)胞重新置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)及純度測(cè)定

將原代及純化的嗅鞘細(xì)胞爬片，用免疫組織化學(xué)方法(ABC法)進(jìn)行鑒定。細(xì)胞爬片后將爬片取出，置于另一24孔板內(nèi)，PBS洗兩遍;40%多聚甲醛固定，PBS洗片;滴加一抗A(1∶100)，37 ℃孵育;再次 PBS沖洗;滴加試劑 B(IgG/Bio)，孵育后PBS沖洗;滴加試劑C(S-A/HRP)，孵育后PBS沖洗后THB漂洗一次;室溫下暗處放置;細(xì)胞核襯染，浸入蘇木精染液2 min;甘油封片。

1.4 脊髓橫斷傷模型的建立及其嗅鞘細(xì)胞移植

1.4.1 脊髓橫斷傷模型的建立［5］60只大鼠，隨機(jī)分為A組(細(xì)胞移植組)、B組(陰性對(duì)照組)、C組(空白對(duì)照組)，每組20只;0.4%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物，成功后，A、B、C組無(wú)菌條件下逐層切開(kāi)分離組織至T13～L1椎體，咬除椎板，顯示腰膨大;A、B、C組于手術(shù)顯微鏡下縱向切開(kāi)硬脊膜約0.5 cm，借助腦膜鑷用虹膜刀沿脊髓后動(dòng)脈左側(cè)切入，并適度旋轉(zhuǎn)以攪毀局部脊髓，然后用負(fù)壓吸引器吸收損毀的脊髓組織，從而在半切脊髓的基礎(chǔ)上又造成直徑約2 mm，深達(dá)脊髓腹側(cè)硬脊膜的盲洞損傷，以用于移植供體組織。

1.4.2 嗅鞘細(xì)胞移植 A組脊髓損傷部位注入OECs細(xì)胞懸液，其細(xì)胞濃度為2×105/mL。B組脊髓損傷部位注入0.5 μl的無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。C組只損傷脊髓，不做處理。

1.5 移植后脊髓功能的恢復(fù)數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)

1.5.1 下肢運(yùn)動(dòng)功能檢查評(píng)價(jià) 爬坡試驗(yàn):傾斜45°～50°的鋼絲網(wǎng)長(zhǎng)40 cm，寬50 cm，動(dòng)物由下向上爬行。Tarlov評(píng)分:0級(jí):下肢無(wú)收縮;Ⅰ級(jí):下肢肌肉有收縮，髖、膝關(guān)節(jié)無(wú)活動(dòng);Ⅱ級(jí):髖、膝關(guān)節(jié)無(wú)活動(dòng)但不能承重;Ⅲ級(jí):能承重，但不能主動(dòng)攀登;Ⅳ級(jí):能主動(dòng)攀登。BBB評(píng)分:根據(jù)后肢體位、活動(dòng)方式、活動(dòng)范圍來(lái)定義，其總得分為21分。

1.5.2 電生理檢查［6］移植后6、12周行誘發(fā)電位檢查，采用經(jīng)顱磁刺激法，刺激強(qiáng)度為80%，將電極置于小腿三頭肌記錄運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位，參考電極及地線分別置于同側(cè)跟腱及膝部。

1.5.3 組織學(xué)檢查-銀染 術(shù)后12周，所有存活大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉后，用等滲鹽水及4%多聚甲醛做心臟灌注固定，取脊髓損傷區(qū)遠(yuǎn)、近端常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片，包括縱向和橫向，其厚度為10 μm。用N F單克隆抗體，采用ABC法(方法同上)做免疫組化染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)與純化

倒置相差顯微鏡下，培養(yǎng)36 h以后，細(xì)胞完成貼壁，多級(jí)的、平角的細(xì)胞成分較多;純化后4 d(圖1a)，雙極或多極的細(xì)胞類型增加，平角細(xì)胞類型減少，免疫熒光證明平角細(xì)胞為成纖維細(xì)胞類型;純化后14 d(圖1b)，細(xì)胞生長(zhǎng)密集，部分細(xì)胞已接觸，細(xì)胞形態(tài)為雙極為多。分離培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行P75免疫組化染色，在倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)雙極或三極的嗅鞘細(xì)胞胞體(圖1c)。顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)(一個(gè)視野下，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))得出該法分離培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞在95%以上。

2.2 術(shù)后脊髓組織學(xué)觀察

A組:脊髓損傷區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，纖維走向雜亂，沒(méi)有一致的方向，細(xì)胞數(shù)目較B組多，其遠(yuǎn)端的神經(jīng)纖維的數(shù)目明顯少于近端。B組:脊髓損傷后3 h脊髓灰質(zhì)中多灶性出血，白質(zhì)尚正常;6 h后灰質(zhì)中出血增多，遍布全灰質(zhì)，白質(zhì)水腫;12 h后白質(zhì)出現(xiàn)出血灶，灰質(zhì)中神經(jīng)細(xì)胞退變壞死，白質(zhì)中神經(jīng)軸突開(kāi)始退變;24 h灰質(zhì)中心出現(xiàn)壞死，白質(zhì)中多處軸突退變;48 h中心軟化，白質(zhì)退變;晚期為膠質(zhì)組織替代，正常的脊髓組織結(jié)構(gòu)中斷，代以增生的纖維狀瘢痕組織，僅少量的神經(jīng)纖維可以通過(guò)橫斷區(qū)界面，脊髓損傷段常有空洞存在，近端可有少許的神經(jīng)纖維存在。C組:早期的與B組相同，后期沒(méi)有神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)。術(shù)后12周，組織學(xué)檢查-銀染結(jié)果(圖1d)可見(jiàn)深棕色的神經(jīng)纖維。

圖1 大鼠嗅鞘細(xì)胞培養(yǎng)和術(shù)后脊髓組織學(xué)觀察

2.3 移植術(shù)后脊髓運(yùn)動(dòng)功能、電生理改變

術(shù)后脊髓運(yùn)動(dòng)功能的改變:A組死亡4只，B組死亡2只，C組沒(méi)有死亡。術(shù)后2周:A組大鼠后肢有少許功能恢復(fù)，B組、C組后肢沒(méi)有任何運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。術(shù)后4周:A組大鼠的BBB得分穩(wěn)定增加，達(dá)到4分;B組、C組有少許的運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，但其BBB得分小于一分。術(shù)后6～12周:A組大鼠后肢得分達(dá)到12分，B組、C組維持在3分左右。A組在各個(gè)時(shí)間段得分及其增長(zhǎng)幅度均高于B組、C組得分，但其平均得分與正常值差別較大;B組、C組得分的均值差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

術(shù)后電生理的變化:刺激左側(cè)脛神經(jīng)，在對(duì)側(cè)皮層可以記錄到一穩(wěn)定的“W型”波，波峰向下定義為正波波峰向上為負(fù)波(N波)。從波形上可以看出，由于P1N1比較穩(wěn)定，所以我們選用N1波作為測(cè)量指標(biāo)。正常大鼠的N1潛伏時(shí)和波幅分別為(19.09 ±1.01)ms，(1.92 ±0.84)μV 。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)各組動(dòng)物的CSEP潛伏時(shí)和波幅數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表1 脊髓損傷后不同時(shí)間各組動(dòng)物BBB得分

表2 術(shù)后各組6、12周N1波的潛伏時(shí)和波幅

3 討論

本試驗(yàn)在嗅鞘細(xì)胞的分離、純化，采用了不同的純化方法，取得了滿意了效果。在純化階段，我們采用過(guò)差速貼壁法［7］、Ara C純化、免疫吸附3種方法;Ara C是一種使用較多的純化方法，作為一種抑制細(xì)胞有絲分裂的抑制劑，在抑制成纖維細(xì)胞的同時(shí)也抑制了嗅鞘細(xì)胞;我們應(yīng)用p75抗體包被培養(yǎng)皿進(jìn)行免疫吸附，并使用Thy1.1抗體結(jié)合補(bǔ)體對(duì)成纖維樣細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用殺滅污染細(xì)胞達(dá)到純化目的，細(xì)胞的純度一般都在95%以上，在接種細(xì)胞密度時(shí)，我們通過(guò)比較認(rèn)為以106/mL接種時(shí)對(duì)細(xì)胞的純化最有利，其缺點(diǎn)是價(jià)格較貴，步驟較繁瑣。

由于神經(jīng)細(xì)胞屬于不可再生細(xì)胞類型，其再生能力較差，特別是神經(jīng)壞死后其微環(huán)境的破壞，加劇了其再生的難度。人們從哺乳動(dòng)物的嗅神經(jīng)的毀損后的嗅功能的喪失和恢復(fù)的過(guò)程中得到啟發(fā)并做了大量的研究。1897年有文獻(xiàn)最早闡明了哺乳動(dòng)物嗅球中存在兩種大膠質(zhì)細(xì)胞:星形細(xì)胞和梭形細(xì)胞，前者是星形膠質(zhì)細(xì)胞，后者現(xiàn)已被證明是OECs［8］。隨著人們對(duì)OECs的不斷深入研究，OECs的生物學(xué)特性逐漸被揭曉，其移植治療脊髓損傷的效果也得到認(rèn)可，本試驗(yàn)就是在這樣的背景下探討嗅鞘細(xì)胞對(duì)脊髓損傷的潛在治療的效果。

脊髓損傷后，由于軸突的再生能力較差，及其局部微環(huán)境的破壞和膠質(zhì)瘢痕的限制，導(dǎo)致了神經(jīng)功能恢復(fù)的難度較大。嗅鞘細(xì)胞能有效的促進(jìn)軸突的再生和微環(huán)境的復(fù)原。本試驗(yàn)采用細(xì)胞移植的方法，并使用BBB功能評(píng)分和免疫組織化學(xué)的評(píng)定方式，從功能和形態(tài)學(xué)兩方面對(duì)脊髓損傷的恢復(fù)情況做了較為客觀的評(píng)價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果證明，嗅鞘細(xì)胞能有效的促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。試驗(yàn)組與對(duì)照組的結(jié)果比較，其有效性顯而易見(jiàn)。術(shù)后的神經(jīng)電生理的變化，也間接的支持毀損神經(jīng)的再生。

作為一種新的研究方法，嗅鞘細(xì)胞其特有的生物學(xué)性狀使其成為目前細(xì)胞移植治療脊髓損傷最有應(yīng)用前景的候選細(xì)胞之一。但是，隨著研究的進(jìn)一步深入存在諸多方面的不足。由本試驗(yàn)可以看出:雖然細(xì)胞移植組較對(duì)照組有較大的神經(jīng)功能的改善，但其BBB評(píng)分在12分左右就停滯不前，與其功能的完全恢復(fù)差距較遠(yuǎn);作為種子細(xì)胞，嗅鞘細(xì)胞的生物學(xué)特性沒(méi)有完全得到闡明。

［1］Stamegna JC，F(xiàn)elix MS，Roux-Peyronnet J，et al.Nasal OEC transplantation promotes respiratory recovery in a subchronic rat model of cervical spinal cord contusion［J］.Exp Neurol，2011;229(1):120-131.

［2］Gomes ME，Reis RL，Cunha AM，et al.Cytocompatibility and response of osteoblastic-like cells to starch-based polymers:effect of several additives and processing conditions［J］.Biomaterials，2001，22(13):1911-1917.

［3］Cancalon PF.Survival and subsequent regeneration of olfactory neurons after a distal axonal lesion［J］.J Neurocytol，1987;16(6):829-841.

［4］Heredia M，Gascuel J，Ramón-Cueto A，et al.Two novel monoclonal antibodies(1.9.E and 4.11.C)against olfactory bulb ensheathing glia［J］.Glia 1998，24(3):352-364.

［5］黃紅云，陳 琳，王洪美，等.年齡對(duì)嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷療效的影響［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，24(1):56-59.

［6］任繼鑫，孫天勝.嗅鞘膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及在脊髓損傷中的應(yīng)用［J］.中國(guó)脊柱脊髓雜志，2002，129(5):385-387.

［7］Nash HH，Borke RC，Anders J.New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb［J］.Glia，2001，34(2):81-87.

［8］Pressler RT，Strowbridge BW.Blanes cells mediate persistent feedforward inhibition onto granule cells in the olfactory bulb［J］.Neuron，2006，49(6):889-904.