姜復齡，何 佳 (.第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所脊柱外科，重慶40004;.華中科技大學附屬同濟醫(yī)院神經內科，湖北武漢400030)

近年來，嗅鞘細胞(OECs)移植治療脊髓損傷有新的進展。Stamegna等［1］在比較 OECs、SCs及新生大腦細胞移植治療脊髓脫髓鞘模型時發(fā)現(xiàn)，電生理測得OECs和SCs組軸突的傳導速度和反應頻率提高，說明軸突重新髓鞘化。將人胚胎嗅球嗅鞘細胞移植對117例不同脊髓節(jié)段損傷的晚期患者進行治療，都有不同程度的脊髓功能的恢復［2］。除單純OECs移植外，基因修飾后的OECs移植亦具有促進神經再生的功能，而且作用可能更大。除此之外，嗅鞘細胞與傳統(tǒng)的神經營養(yǎng)素家族細胞基因的修飾［3］，與端粒酶逆轉錄酶基因導致的永生化［4］，進一步的提升了嗅鞘細胞在脊髓損傷治療方面的功能。本實驗探討純化的大鼠嗅鞘細胞對損傷的脊髓的修復作用，評價其作為脊髓損傷治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，小鼠抗大鼠Thy1.1單克隆抗體、羊抗小鼠IgG(Sigma公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，多聚氨酸(poly-L-Lysine:Sigma公司)，阿糖胞苷(arabinoside cytosi Ara-c:Sigma公司)，牛垂體提取物(bovine pituitary extract BPE:Sigma公司)，F(xiàn)orskolin(Sigma公司)，DAB免疫組化試劑盒(北京中山公司)，GENMED冰凍切片神經纖維銀染試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，實驗動物新生Wistar大鼠由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供(許可號:20051006)。

1.2 嗅鞘細胞的分離和純化

無菌環(huán)境下完整分離大鼠嗅球，剝除軟腦膜和血管膜(解剖顯微鏡下)，機械分離嗅球成3組1～2 mm織小塊。用0.2%胰酶37℃孵箱中消化30 min，濾網濾過組織殘渣，收取細胞懸液，1 000r/min離心15 min，棄上清加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基清洗，最后用10%FBS完全培養(yǎng)基重懸細胞成單細胞懸液，接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，放入細胞培養(yǎng)箱。

采用改良Nash差速貼壁法和Ara-c化學抑制純化培養(yǎng)OECs。Ara-c終濃度為1×105mol/L，作用48 h，加入條件培養(yǎng)基(10%FBS+20 μmol/L forskolin+20 μg/L BPE+DMEM/F12)純化培養(yǎng)。細胞與小鼠抗大鼠Thy1.1單克隆抗體共同孵育30 min，沖洗后去除多余的抗體;細胞置于羊抗小鼠IgG包被的培養(yǎng)瓶中4℃下孵育1 h后細胞重新置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.3 免疫組織化學方法檢測及純度測定

將原代及純化的嗅鞘細胞爬片，用免疫組織化學方法(ABC法)進行鑒定。細胞爬片后將爬片取出，置于另一24孔板內，PBS洗兩遍;40%多聚甲醛固定，PBS洗片;滴加一抗A(1∶100)，37 ℃孵育;再次 PBS沖洗;滴加試劑 B(IgG/Bio)，孵育后PBS沖洗;滴加試劑C(S-A/HRP)，孵育后PBS沖洗后THB漂洗一次;室溫下暗處放置;細胞核襯染，浸入蘇木精染液2 min;甘油封片。

1.4 脊髓橫斷傷模型的建立及其嗅鞘細胞移植

1.4.1 脊髓橫斷傷模型的建立［5］60只大鼠，隨機分為A組(細胞移植組)、B組(陰性對照組)、C組(空白對照組)，每組20只;0.4%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉動物，成功后，A、B、C組無菌條件下逐層切開分離組織至T13～L1椎體，咬除椎板，顯示腰膨大;A、B、C組于手術顯微鏡下縱向切開硬脊膜約0.5 cm，借助腦膜鑷用虹膜刀沿脊髓后動脈左側切入，并適度旋轉以攪毀局部脊髓，然后用負壓吸引器吸收損毀的脊髓組織，從而在半切脊髓的基礎上又造成直徑約2 mm，深達脊髓腹側硬脊膜的盲洞損傷，以用于移植供體組織。

1.4.2 嗅鞘細胞移植 A組脊髓損傷部位注入OECs細胞懸液，其細胞濃度為2×105/mL。B組脊髓損傷部位注入0.5 μl的無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。C組只損傷脊髓，不做處理。

1.5 移植后脊髓功能的恢復數(shù)據(jù)監(jiān)測

1.5.1 下肢運動功能檢查評價 爬坡試驗:傾斜45°～50°的鋼絲網長40 cm，寬50 cm，動物由下向上爬行。Tarlov評分:0級:下肢無收縮;Ⅰ級:下肢肌肉有收縮，髖、膝關節(jié)無活動;Ⅱ級:髖、膝關節(jié)無活動但不能承重;Ⅲ級:能承重，但不能主動攀登;Ⅳ級:能主動攀登。BBB評分:根據(jù)后肢體位、活動方式、活動范圍來定義，其總得分為21分。

1.5.2 電生理檢查［6］移植后6、12周行誘發(fā)電位檢查，采用經顱磁刺激法，刺激強度為80%，將電極置于小腿三頭肌記錄運動誘發(fā)電位，參考電極及地線分別置于同側跟腱及膝部。

1.5.3 組織學檢查-銀染 術后12周，所有存活大鼠經腹腔內注射麻醉后，用等滲鹽水及4%多聚甲醛做心臟灌注固定，取脊髓損傷區(qū)遠、近端常規(guī)石蠟包埋、連續(xù)切片，包括縱向和橫向，其厚度為10 μm。用N F單克隆抗體，采用ABC法(方法同上)做免疫組化染色。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠嗅鞘細胞培養(yǎng)與純化

倒置相差顯微鏡下，培養(yǎng)36 h以后，細胞完成貼壁，多級的、平角的細胞成分較多;純化后4 d(圖1a)，雙極或多極的細胞類型增加，平角細胞類型減少，免疫熒光證明平角細胞為成纖維細胞類型;純化后14 d(圖1b)，細胞生長密集，部分細胞已接觸，細胞形態(tài)為雙極為多。分離培養(yǎng)的嗅鞘細胞進行P75免疫組化染色，在倒置相差顯微鏡下可見雙極或三極的嗅鞘細胞胞體(圖1c)。顯微鏡下細胞計數(shù)(一個視野下，陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù))得出該法分離培養(yǎng)的嗅鞘細胞在95%以上。

2.2 術后脊髓組織學觀察

A組:脊髓損傷區(qū)結構紊亂，纖維走向雜亂，沒有一致的方向，細胞數(shù)目較B組多，其遠端的神經纖維的數(shù)目明顯少于近端。B組:脊髓損傷后3 h脊髓灰質中多灶性出血，白質尚正常;6 h后灰質中出血增多，遍布全灰質，白質水腫;12 h后白質出現(xiàn)出血灶，灰質中神經細胞退變壞死，白質中神經軸突開始退變;24 h灰質中心出現(xiàn)壞死，白質中多處軸突退變;48 h中心軟化，白質退變;晚期為膠質組織替代，正常的脊髓組織結構中斷，代以增生的纖維狀瘢痕組織，僅少量的神經纖維可以通過橫斷區(qū)界面，脊髓損傷段常有空洞存在，近端可有少許的神經纖維存在。C組:早期的與B組相同，后期沒有神經纖維的生長。術后12周，組織學檢查-銀染結果(圖1d)可見深棕色的神經纖維。

圖1 大鼠嗅鞘細胞培養(yǎng)和術后脊髓組織學觀察

2.3 移植術后脊髓運動功能、電生理改變

術后脊髓運動功能的改變:A組死亡4只，B組死亡2只，C組沒有死亡。術后2周:A組大鼠后肢有少許功能恢復，B組、C組后肢沒有任何運動功能恢復。術后4周:A組大鼠的BBB得分穩(wěn)定增加，達到4分;B組、C組有少許的運動功能的恢復，但其BBB得分小于一分。術后6～12周:A組大鼠后肢得分達到12分，B組、C組維持在3分左右。A組在各個時間段得分及其增長幅度均高于B組、C組得分，但其平均得分與正常值差別較大;B組、C組得分的均值差別無統(tǒng)計學意義，見表1。

術后電生理的變化:刺激左側脛神經，在對側皮層可以記錄到一穩(wěn)定的“W型”波，波峰向下定義為正波波峰向上為負波(N波)。從波形上可以看出，由于P1N1比較穩(wěn)定，所以我們選用N1波作為測量指標。正常大鼠的N1潛伏時和波幅分別為(19.09 ±1.01)ms，(1.92 ±0.84)μV 。術后不同時間點各組動物的CSEP潛伏時和波幅數(shù)據(jù)見表2。

表1 脊髓損傷后不同時間各組動物BBB得分

表2 術后各組6、12周N1波的潛伏時和波幅

3 討論

本試驗在嗅鞘細胞的分離、純化，采用了不同的純化方法，取得了滿意了效果。在純化階段，我們采用過差速貼壁法［7］、Ara C純化、免疫吸附3種方法;Ara C是一種使用較多的純化方法，作為一種抑制細胞有絲分裂的抑制劑，在抑制成纖維細胞的同時也抑制了嗅鞘細胞;我們應用p75抗體包被培養(yǎng)皿進行免疫吸附，并使用Thy1.1抗體結合補體對成纖維樣細胞產生細胞毒作用殺滅污染細胞達到純化目的，細胞的純度一般都在95%以上，在接種細胞密度時，我們通過比較認為以106/mL接種時對細胞的純化最有利，其缺點是價格較貴，步驟較繁瑣。

由于神經細胞屬于不可再生細胞類型，其再生能力較差，特別是神經壞死后其微環(huán)境的破壞，加劇了其再生的難度。人們從哺乳動物的嗅神經的毀損后的嗅功能的喪失和恢復的過程中得到啟發(fā)并做了大量的研究。1897年有文獻最早闡明了哺乳動物嗅球中存在兩種大膠質細胞:星形細胞和梭形細胞，前者是星形膠質細胞，后者現(xiàn)已被證明是OECs［8］。隨著人們對OECs的不斷深入研究，OECs的生物學特性逐漸被揭曉，其移植治療脊髓損傷的效果也得到認可，本試驗就是在這樣的背景下探討嗅鞘細胞對脊髓損傷的潛在治療的效果。

脊髓損傷后，由于軸突的再生能力較差，及其局部微環(huán)境的破壞和膠質瘢痕的限制，導致了神經功能恢復的難度較大。嗅鞘細胞能有效的促進軸突的再生和微環(huán)境的復原。本試驗采用細胞移植的方法，并使用BBB功能評分和免疫組織化學的評定方式，從功能和形態(tài)學兩方面對脊髓損傷的恢復情況做了較為客觀的評價。試驗結果證明，嗅鞘細胞能有效的促進神經功能的恢復。試驗組與對照組的結果比較，其有效性顯而易見。術后的神經電生理的變化，也間接的支持毀損神經的再生。

作為一種新的研究方法，嗅鞘細胞其特有的生物學性狀使其成為目前細胞移植治療脊髓損傷最有應用前景的候選細胞之一。但是，隨著研究的進一步深入存在諸多方面的不足。由本試驗可以看出:雖然細胞移植組較對照組有較大的神經功能的改善，但其BBB評分在12分左右就停滯不前，與其功能的完全恢復差距較遠;作為種子細胞，嗅鞘細胞的生物學特性沒有完全得到闡明。

［1］Stamegna JC，F(xiàn)elix MS，Roux-Peyronnet J，et al.Nasal OEC transplantation promotes respiratory recovery in a subchronic rat model of cervical spinal cord contusion［J］.Exp Neurol，2011;229(1):120-131.

［2］Gomes ME，Reis RL，Cunha AM，et al.Cytocompatibility and response of osteoblastic-like cells to starch-based polymers:effect of several additives and processing conditions［J］.Biomaterials，2001，22(13):1911-1917.

［3］Cancalon PF.Survival and subsequent regeneration of olfactory neurons after a distal axonal lesion［J］.J Neurocytol，1987;16(6):829-841.

［4］Heredia M，Gascuel J，Ramón-Cueto A，et al.Two novel monoclonal antibodies(1.9.E and 4.11.C)against olfactory bulb ensheathing glia［J］.Glia 1998，24(3):352-364.

［5］黃紅云，陳 琳，王洪美，等.年齡對嗅鞘細胞移植治療脊髓損傷療效的影響［J］.首都醫(yī)科大學學報，2003，24(1):56-59.

［6］任繼鑫，孫天勝.嗅鞘膠質細胞的培養(yǎng)、鑒定及在脊髓損傷中的應用［J］.中國脊柱脊髓雜志，2002，129(5):385-387.

［7］Nash HH，Borke RC，Anders J.New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb［J］.Glia，2001，34(2):81-87.

［8］Pressler RT，Strowbridge BW.Blanes cells mediate persistent feedforward inhibition onto granule cells in the olfactory bulb［J］.Neuron，2006，49(6):889-904.