林煥樂(lè) 王澤峰 馬劍茵

浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 舟山 316004

蝦蛄多肽的酶解工藝及其抗腫瘤活性的初步研究

林煥樂(lè) 王澤峰 馬劍茵

浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 舟山 316004

目的：通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件，提取分離蝦蛄軟體組織，根據(jù)其體外抗腫瘤活性，篩選最佳酶解條件。方法：采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過(guò)探索其抗前列腺癌作用，優(yōu)化胰蛋白酶酶解蝦蛄多肽的提取條件。結(jié)果：蝦蛄多肽酶解最佳條件為：料液比1∶2，pH為7.5，加酶量為1000u/g，溫度40℃，時(shí)間為4h，其對(duì)前列腺癌PC－3細(xì)胞株的體外抑制率為60.9%。結(jié)論酶解所得的蝦蛄多肽對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有一定的抑制生長(zhǎng)作用。

蝦蛄多肽；酶解；前列腺癌細(xì)胞；正交試驗(yàn)

近年來(lái)，有關(guān)生物活性肽的研發(fā)極為活躍，目前已有多種產(chǎn)品問(wèn)世。來(lái)自海洋生物的活性肽盡管研發(fā)歷史較短，但因其具有的獨(dú)特生理功能而異軍突起，成為活性肽領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。海洋生物活性物質(zhì)抗腫瘤研究是海洋生物活性物質(zhì)開發(fā)與抗癌藥物研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。從眾多的海洋生物中尋找有效的抗癌藥物，提取制備海洋生物活性物質(zhì)并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行篩選是其中的研究重點(diǎn)［1－3］。

蝦蛄在江浙一帶俗稱蝦拔彈、蝦鉤彈，在北方一帶俗稱蝦爬子，日本人稱之為螳螂蝦。它隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、口足目。蝦蛄與其他品種相比，具有能自然越冬、抗害避難和養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)小的優(yōu)點(diǎn)，值得推廣養(yǎng)殖［4］。近年來(lái)，規(guī)?；B(yǎng)殖蝦蛄的水產(chǎn)業(yè)越來(lái)越多。本文采用胰蛋白酶水解蝦蛄軟體組織，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解條件，提取制備蝦蛄多肽，研究其體外抗腫瘤活性，篩選最佳酶解條件。

1 儀器與材料

1.1 材料 蝦蛄采集自舟山群島海域；前列腺癌細(xì)胞PC－3（原購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存）；胰蛋白酶等試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 （分析純）。

1.2 主要儀器與設(shè)備 HH－S型水浴鍋（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；FD－1000冷凍干燥機(jī)（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；BS－100A自動(dòng)部分收集器（上海瀘西分析儀器廠有限公司）；CR21G冷凍離心機(jī)（日本日立）；DHG－9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海一恒科技有限公司）；FiveEosy實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)；JJ－2組織搗碎機(jī)（上海梅香儀器有限公司）；RE－2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；EYELA CA－III循環(huán)冷凍儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；SHB－III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科技有限公司）；Sephadex G－25凝膠柱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酶解工藝 酶解工藝參照Sheih等［5］的方法，采用胰蛋白酶水解蝦蛄軟體組織。將蝦蛄洗凈去殼，將蝦蛄肉進(jìn)行勻漿，用0.1mol/L的HCl和0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值，加入胰蛋白酶進(jìn)行保溫水解，水解完成后100℃、10min進(jìn)行滅酶，將水解液8000r/min離心20min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 選取人前列腺癌細(xì)胞PC－3（原購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存），用含10%胎牛血清的F12完全培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，0.25%的胰蛋白酶消化，每2～3天傳代1次，實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定 采用MTT法檢測(cè)。配制PBS溶液（pH值為7.2）和分別配置上述16組正交實(shí)驗(yàn)的蝦蛄多肽溶液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌PC－3細(xì)胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200μL，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h。然后分別加入不同酶解工藝制得的蝦蛄多肽（10mg/mL），每組分別設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)不加藥作為對(duì)照組，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育72h。培養(yǎng)結(jié)束后，加PBS溶液（pH值為7.2）清洗3次，再加MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄MTT，加二甲基亞砜每孔150μL，置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制指數(shù)（IR），按下列公式計(jì)算：

2.4 酶解工藝的影響因素和優(yōu)化 觀察A（料液比）、B（pH）、C（加酶量）、D（溫度）、E（時(shí)間）等因素對(duì)酶解工藝的影響，每個(gè)因素選四個(gè)水平進(jìn)行L16（45）的正交實(shí)驗(yàn)，比較胰蛋白酶在不同水解條件下的抗腫瘤活性，從而確定最佳酶解條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 酶解工藝條件對(duì)抗腫瘤活性的影響

3.1.1 料液比對(duì)PC－3細(xì)胞增殖抑制率的影響

如圖1所示：在一定的料液比例下，隨著料液比的增

加，抗腫瘤活性下降，但當(dāng)比例繼續(xù)增大時(shí)，抑制率又有所增加，料液比對(duì)胰酶酶解蝦蛄多肽有較大的影響。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得當(dāng)料液比為1：2時(shí)，抗腫瘤活性最優(yōu)。

3.1.2 pH值對(duì)PC－3細(xì)胞增殖抑制率的影響 如圖2所示：在一定的范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，抗腫瘤活性呈現(xiàn)先上升趨勢(shì)，再繼續(xù)增加pH值，抗腫瘤活性又有所下降，繼而又緩慢上升。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得當(dāng)pH值為7.5時(shí)抗腫瘤活性最高。

3.1.3 加酶量對(duì)PC－3細(xì)胞增殖抑制率的影響 如圖3所示：加酶量的改變，蝦蛄抗腫瘤活性呈現(xiàn)交替現(xiàn)象，當(dāng)加酶量為500－1000u時(shí)抗腫瘤活性增加；當(dāng)加酶量為1000－1500u時(shí)，抗腫瘤活性下降；繼續(xù)增加500u抗腫瘤活性又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

3.1.4 酶解溫度對(duì)PC－3細(xì)胞增殖抑制率的影響 如圖4所示，酶解溫度對(duì)胰蛋白酶酶解蝦蛄多肽的抗腫瘤活性變化明顯。在一定范圍內(nèi)，隨著溫度增加，抗腫瘤活性上升，繼續(xù)增加溫度，抗腫瘤活性又下降。當(dāng)溫度為40℃時(shí)，抗腫瘤活性最佳。

3.1.5 酶解時(shí)間對(duì)PC－3細(xì)胞增殖抑制率的影響 如圖5所示：隨著酶解時(shí)間的增加，抗腫瘤活性先緩慢增加，繼而呈現(xiàn)迅速下降，再逐漸趨于平緩。其中，4h時(shí)的抗腫瘤活性最強(qiáng)?？梢?，酶解時(shí)間對(duì)胰酶酶解蝦蛄多肽有一定的影響，以4h最優(yōu)。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝

表1 Trypsin正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果L16（45）

結(jié)果表明，影響前列腺癌PC－3細(xì)胞增殖抑制率的各因素的主次順序?yàn)椋篈（料液比）＞E（時(shí)間h）＞D（溫度℃）＞C（加酶量u/g）＞B（pH值）。IR值最大時(shí)的水解條件為A1B2C2D2E2，即料液比為料液比1：2，pH為7.5，加酶量為1000u/g，溫度40℃，時(shí)間為4h，其對(duì)前列腺癌PC－3細(xì)胞株的體外抑制率為60.9%。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)蝦蛄多肽體外抗前列腺癌PC－3細(xì)胞活性進(jìn)行了正交試驗(yàn)分析，篩選出了胰蛋白酶酶解的最優(yōu)條件，其抗腫瘤活性多肽的進(jìn)一步分離純化以及作用機(jī)制有待于深入研究。

［1］歐陽(yáng)高亮，李祺福，田長(zhǎng)海.海洋生物抗腫瘤活性物質(zhì)及其作用機(jī)理研究進(jìn)展［J］.海洋科學(xué)，2003，27（7）：21－24.

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R931.4

A

1007－8517（2013）10－0016－03

2013.04.15）

林煥樂(lè)（1990－），女，大學(xué)本科.

馬劍茵※（1962－），女，教授，碩士生導(dǎo)師，從事海洋生物活性成分的藥理研究.E－mail：chymjy＠zjou.edu.cn.